甲基硒酸對嬰幼兒血管瘤內皮細胞增殖和凋亡的影響及其分子機制的研究

王曉慶 劉九月 姚光 孫玉梅

嬰幼兒血管瘤(Infantile hemangioma，IH)是嬰幼兒最常見的皮膚良性腫瘤，其發(fā)病率約為4%～5%[1]。研究發(fā)現，女性、白種人、低體重早產兒和多胞胎的IH發(fā)病率較高[2]。IH發(fā)病機制較為復雜，其中IH早期內皮細胞快速增殖是其進展的重要因素。因此，抑制增殖期IH內皮細胞增殖，促進其凋亡，對IH防治意義重大。甲基硒酸是一種高效的第二代硒化合物，是最有效的體外化學預防劑。研究顯示，甲基硒酸可抑制口腔鱗狀細胞癌、肺癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，抑制肺癌裸鼠移植瘤的生長[3-5]。此外，甲基硒酸可能通過上調miR-146a對食管鱗癌細胞產生明顯的增殖抑制作用[6]。但甲基硒酸在IH中是否具有抗腫瘤作用尚未可知。miR-499a-5p是近年發(fā)現的微小RNA，上調miR-499a-5p對膠質瘤細胞的惡性生物學行為具有顯著抑制作用[7]。但miR-499a-5p在IH中的作用尚未可知，本研究擬通過觀察甲基硒酸對血管瘤內皮細胞增殖、凋亡以及miR-499a-5p表達的影響，初步探討其可能的分子機制，以期為IH的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

M199培養(yǎng)液(Gibco公司，美國)；甲基硒酸、胰蛋白酶(Sigma公司，美國)；LipofectamineTM2000、Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)；miR-499a-5p模擬物miR-499a-5p mimics及其陰性對照miR-NC、抑制物anti-miR-499a-5p及其陰性對照anti-miR-NC(廣州銳博生物技術公司)；MTT試劑盒、膜聯蛋白-異硫氰酸熒光素(AnnexinⅤ-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒(南京科元生物技術公司)；兔抗Cyclin D1抗體、鼠抗p21抗體、兔抗Bcl-2抗體、鼠抗Bax抗體、兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(上海碧云天生物技術研究所)；一步法miRNA逆轉錄試劑盒(Thermo Fisher公司，美國)；SYBR Green master mix(大連寶生生物技術公司)。

選取2016年至2018年于我院整形外科進行手術的增殖期IH標本5例，均獲患兒監(jiān)護人知情同意?；純耗挲g為3～14月齡；男2例，女3例。所有患兒均未接受其他針對性治療。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉染

參照文獻[8]的方法，從新鮮IH標本中剝離單個瘤體，將瘤體剪碎，按照組織塊間距3 mm置于培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶倒置，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)6 h，棄去上清液。加入2 mL的M199培養(yǎng)液(含20%胎牛血清、70 ptg/L生長因子使用液、100 μL/mL肝素)，然后分裝于鋪有明膠的25 mL培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2、濕潤培養(yǎng)箱中孵育24 h后更換培養(yǎng)液，以后每周換液2～3次。培養(yǎng)30 d左右長成單層細胞，當細胞融合度達到90%時，胰酶消化傳代。將對數生長期血管瘤內皮細胞制成5×104個/mL的單細胞懸液。取2 mL細胞懸液加入到6孔板，當細胞融合度達到50%時參照脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000說明書進行細胞轉染。轉染48 h后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組

分別采用低、中、高濃度(2.5、5、10 μmol/L)的甲基硒酸作用于血管瘤內皮細胞24 h，依次標記為甲基硒酸低濃度(MSA-L)組、甲基硒酸中濃度(MSA-M)組、甲基硒酸高濃度(MSA-H)組，單純血管瘤內皮細胞設為對照(Con)組。按照下述方法步驟檢測細胞增殖抑制率、凋亡率、Cyclin D1(增殖相關蛋白)、p21(增殖相關蛋白)、Bcl-2(凋亡相關蛋白)、Bax(凋亡相關蛋白)以及miR-499a-5p的表達水平。

為驗證甲基硒酸對血管瘤內皮細胞增殖和凋亡的影響與調控miR-499a-5p表達有關，將血管瘤內皮細胞分為miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-499a-5p組(轉染miR-499a-5p mimics)、MSA+anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC后，10 μmol/L的甲基硒酸作用24 h)、MSA+anti-miR-499a-5p組(轉染anti-miR-499a-5p后，10 μmol/L的甲基硒酸作用24 h)。按照下述實驗步驟檢測細胞增殖、凋亡以及相關蛋白表達情況。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖抑制率

取5×103個血管瘤內皮細胞接種96孔板，按照實驗分組進行處理后，各孔中加入20 μL的MTT溶液(質量濃度為5 mg/mL)。4 h后移液槍吸去所有培養(yǎng)液，各孔中加入150 μL的二甲基亞砜溶液，旋渦振蕩器振蕩10 min溶解甲臜顆粒，酶標儀在490 nm處檢測吸光度值。增殖抑制率=[(A對照孔-A實驗孔)/(A對照孔-A空白孔)]×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

取1×105個血管瘤內皮細胞接種于6孔板，按照實驗分組進行處理后，胰酶消化細胞制成單細胞懸液。用1×結合緩沖液洗滌細胞1次，1 000 r/min離心5 min收集細胞。加入200 μL的1×結合緩沖液重懸細胞，分別加入5 μL的AnnexinⅤ-FITC、5 μL的碘化丙啶避光染色15 min，補加300 μL的1×結合緩沖液混勻后上機檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 Western-blot檢測Cyclin D1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達

收集各組血管瘤內皮細胞，加入RIPA細胞裂解于冰上裂解15 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清液，測定蛋白濃度后-80 ℃保存?zhèn)溆?。將適量蛋白與等體積1×上樣緩沖液混勻，煮沸5 min后-20 ℃保存?zhèn)溆?。配置濃縮膠、分離膠，上樣后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，當溴酚藍到達凝膠底部時終止電泳。濕法轉膜后，用含5%的脫脂牛奶封閉液37 ℃封閉膜1 h。1∶500稀釋一抗，4 ℃孵育膜過夜。1∶1 000稀釋二抗，37 ℃下孵育1 h。洗膜后，加入化學發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)對各目的條帶進行灰度分析，以目的蛋白和GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.2.6 RT-qPCR檢測miR-499a-5p表達水平

Trizol試劑從各組血管瘤內皮細胞中提取總RNA，一步法miRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA。按照cDNA 2 μL、SYBR Green master mix 10 μL、引物1 μL、雙蒸水6 μL配置20 μL反應體系，于實時PCR系統(tǒng)中進行擴增。2-ΔΔCt法分析miR-499a-5p的相對表達水平。引物序列：miR-499a-5p上游引物5′-ATGTAGCGTGCGACCG-3′，下游引物5′-CAGGC TGACGCACTCTGTGCT-3′；U6上游引物5′-CCATCGGAAGCTCGTATACGAAATT-3′，下游引物5′-GGCCTCTCGAACTTGCGTGTCAG-3′。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 甲基硒酸對血管瘤內皮細胞增殖的影響

如表1和圖1所示，與Con組比較，MSA-L、MSA-M、MSA-H組血管瘤內皮細胞增殖抑制率、p21蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Cyclin D1蛋白表達顯著降低(P<0.05)，且MSA-L、MSA-M、MSA-H三組間上述各指標比較均差異顯著(P<0.05)。

2.2 甲基硒酸對血管瘤內皮細胞凋亡的影響

如表2與圖2所示，與Con組比較，MSA-L、MSA-M、MSA-H組血管瘤內皮細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，且MSA-L、MSA-M、MSA-H三組間上述各指標比較均差異顯著(P<0.05)。

表1 甲基硒酸對血管瘤內皮細胞增殖的影響Table 1 The effect of methylselenic acid on the proliferation of hemangioma endothelial cells

圖1 Western-blot檢測各組血管瘤內皮細胞增殖相關蛋白表達Fig. 1 The expression of proliferation-related proteins in heman-gioma endothelial cells detected by Western-blot

表2 甲基硒酸對血管瘤內皮細胞凋亡的影響Table 2 The effect of methylselenic acid on the apoptosis of hemangioma endothelial cells

2.3 甲基硒酸對血管瘤內皮細胞中miR-499a-5p表達的影響

如表3所示，與Con組比較，MSA-L、MSA-M、MSA-H組血管瘤內皮細胞miR-499a-5p表達顯著升高(P<0.05)，且MSA-L、MSA-M、MSA-H三組間miR-499a-5p的表達均差異顯著(P<0.05)。

2.4 miR-499a-5p過表達對血管瘤內皮細胞增殖的影響

如表4和圖3所示，與miR-NC組比較，miR-499a-5p組血管瘤內皮細胞miR-499a-5p表達、細胞增殖抑制率、p21蛋白表達顯著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達顯著降低(P<0.05)。

2.5 miR-499a-5p過表達對血管瘤內皮細胞凋亡的影響

表5和圖4顯示，與miR-NC組比較，miR-499a-5p組血管瘤內皮細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。

A：Western-blot檢測各組凋亡相關蛋白表達；B：流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況A: The expression of apoptosis-related protein in each group detected by Western-blot; B: Cell apoptosis in each group detected by flow cytometry圖2 甲基硒酸對血管瘤內皮細胞凋亡的影響Fig. 2 The effect of methylselenic acid on the apoptosis of hemangioma endothelial cells

表3 甲基硒酸對血管瘤內皮細胞中miR-499a-5p表達的影響Table 3 The effect of methylselenic acid on the expression of miR-499a-5p in hemangioma endothelial cells

表5 miR-499a-5p過表達對血管瘤內皮細胞凋亡的影響Table 5 The effect of miR-499a-5p overexpression on the apoptosis of hemangioma endothelial cells

A：Western-blot檢測各組凋亡相關蛋白表達；B：流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況A: The expression of apoptosis-related protein in each group detected by Western-blot; B: Cell apoptosis in each group detected by flow cytometry圖4 miR-499a-5p過表達對血管瘤內皮細胞凋亡的影響Fig. 4 The effect of miR-499a-5p overexpression on the apoptosis of hemangioma endothelial cells

2.6 抑制miR-499a-5p表達逆轉了甲基硒酸(10 μmol/L)對血管瘤內皮細胞增殖和凋亡的影響

表6和圖5顯示，與MSA+anti-miR-NC組比較，MSA+anti-miR-499a-5p組血管瘤內皮細胞的miR-499a-5p表達顯著降低(P<0.05)，細胞增殖抑制率、凋亡率、p21和Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。

表6 抑制miR-499a-5p表達逆轉甲基硒酸對血管瘤內皮細胞增殖和凋亡的作用Table 6 The effect of methylselenate on the proliferation and apoptosis of hemangioma endothelial cells was reversed by miR-499a-5p inhibition

A：Western-blot檢測各組增殖、凋亡相關蛋白表達；B：流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況A: The expression of proliferation and apoptosis-related protein in each group detected by Western-blot; B: Cell apoptosis in each group detected by flow cytometry圖5 抑制miR-499a-5p表達逆轉甲基硒酸對血管瘤內皮細胞增殖和凋亡的作用Fig. 5 The effect of methylselenate on the proliferation and apoptosis of hemangioma endothelial cells was reversed by miR-499a-5p inhibition

3 討論

IH是嬰幼兒常見的血管腫瘤之一，盡管約10%的IH病例在1年內能自行消退，但90%的IH病例則需3～4年甚至更長時間才能退化[9]。IH常常伴有潰瘍、瘢痕、出血等潛在并發(fā)癥，可導致呼吸或視力損害甚至死亡[10]。因此，在早期階段積極干預，促進IH自行消退對治療具有重要意義。

硒元素缺乏是導致包括腫瘤在內的多種人類疾病發(fā)生的重要因素。甲基硒酸是一種有機硒衍生物，已被證實在人類腫瘤中具有顯著的化學預防和治療活性。Qiu等[11]的研究表明，甲基硒酸通過抑制Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)/信號轉導與轉錄激活因子3(Signal transduction and transcription activator 3，STAT3)途徑能夠抑制乳腺癌體內移植瘤的生長。Tarrado-Castellarnau等[12]研究的顯示，甲基硒酸處理可促進肺癌A549細胞DNA單鏈斷裂，破壞腫瘤細胞代謝適應能力，誘導G1期細胞周期阻滯和細胞凋亡。此外，甲基硒酸還可促進血管內皮細胞的黏附，抑制其遷移和血管形成，提示甲基硒酸可能是臨床抗腫瘤治療的潛在候選或輔助藥物[13]。與上述抗腫瘤作用一致，本研究顯示甲基硒酸可抑制血管瘤內皮細胞增殖，誘導細胞凋亡，并呈明顯的劑量依賴關系。Bcl-2和Bax是調控細胞凋亡的重要蛋白，當Bax表達增加時，促進Bax/Bax同二聚體的形成，促進細胞凋亡發(fā)生，但Bcl-2表達增加則促進Bcl-2/Bax異二聚體形成從而發(fā)揮抗凋亡作用[14]。p21是細胞周期蛋白激酶(Cyclin dependent kinase，CDKs)抑制劑家族的重要成員，其通過抑制CDKs/Cyclin D1活性抑制DNA復制和修復，阻礙細胞周期進展，具有抗腫瘤作用[15]。本研究顯示，甲基硒酸抑制Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達，促進p21和Bax表達，且呈劑量依賴關系，與功能試驗的結果相吻合。以上結果表明，甲基硒酸對IH具有顯著的抗腫瘤作用。

miRNA是一類內源性非編碼單鏈小分子RNA，其通過與靶基因3′非翻譯區(qū)結合調控真核生物基因表達，參與調控細胞增殖、凋亡、遷移侵襲等多種生物學過程，在包括IH在內的腫瘤發(fā)生中具有重要作用[16]。例如，普萘洛爾通過下調miR-382抑制第10號染色體的磷酸酶和張力酶基因(Phos-phatase and tensin homologne derived from chromosome ten，PTEN)介導的蛋白激酶B(Protein kinase，AKT)/雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路，抑制IH進展[17]。miR-499a-5p因具有抗腫瘤作用，在腫瘤研究中日益受到關注。骨肉瘤中miR-499a-5p表達降低，上調miR-499a-5p通過負調控Mg2+依賴性蛋白磷酸酶1δ(Protein phosphatase magnesium-dependent 1δ，PPM1D)可抑制骨肉瘤細胞的增殖和分化[18]。miR-499a-5p還可降低宮頸癌細胞的增殖、侵襲、遷移能力，抑制其上皮間質轉化，促進細胞凋亡，增強其放射敏感性[19]。本研究發(fā)現，甲基硒酸干預后血管瘤內皮細胞中miR-499a-5p表達顯著升高，提示甲基硒酸的抗IH作用可能與上調miR-499a-5p表達有關。進一步研究發(fā)現，轉染miR-499a-5p mimics上調miR-499a-5p表達亦可抑制血管瘤內皮細胞增殖，促進細胞凋亡，與已有的報道甲基硒酸的抗腫瘤作用一致[11-12]。此外，本研究發(fā)現，抑制miR-499a-5p表達還可逆轉甲基硒酸對血管瘤內皮細胞的增殖抑制和凋亡促進作用，說明甲基硒酸在IH中的抗腫瘤作用可能與上調miR-499a-5p表達有關。

綜上所述，甲基硒酸可能通過上調miR-499a-5p表達進而抑制血管瘤內皮細胞增殖，促進細胞凋亡，這為甲基硒酸在IH防治中的應用提供了新的線索和依據。