豆瓣綠瓶內(nèi)生根和瓶外生根的比較研究

趙一鳴，王鳳云，邱曉暉，張欣燕，劉柏玲

（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東曲阜273165）

豆瓣綠（Peperomia tetraphylla）是草胡椒屬的多年生草本，常叢集而生，因其葉翠綠、寬厚、容易養(yǎng)護(hù)而成為一種備受歡迎的觀賞植物。豆瓣綠主要分布于四川、云南、貴州、廣東、廣西等地，全草可入藥，具有化痰止咳，舒筋活血，消腫止痛的功效，在傳統(tǒng)中藥中，常被用來治療口腔炎、咽喉炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、瘡癤腫毒、骨折、跌打損傷、中暑、痢疾、腹瀉、疳積，以及胃癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等疾病[1-4]。最近的研究報道從豆瓣綠中分離到具有抗腫瘤作用的藥用成分[5，6]。例如，Li 等[7]在豆瓣綠植株中提取出一種新型的環(huán)丁烷型降木脂素，能夠有效地抑制人類前列腺癌細(xì)胞的增殖；于大永等[8-10]發(fā)現(xiàn)豆瓣綠的乙醇提取物可以通過阻斷細(xì)胞周期，誘導(dǎo)白血病U937 細(xì)胞凋亡，從而起到治療白血病的效果，并且還能抑制黑色素瘤A375細(xì)胞增殖；Nishanthi 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，利用豆瓣綠的醇提取物可以有效防治乙二醇導(dǎo)致的小鼠尿石癥。Shi 等[12]在豆瓣綠中提取出了一種叫做Peperobtusin A 的酚類化合物，它可以通過依賴性的半胱天冬酶（Caspase）和p38 MAPK 信號通路誘導(dǎo)U937 淋巴瘤細(xì)胞凋亡。

很多學(xué)者對豆瓣綠的繁殖進(jìn)行了研究。郝靜韋[13]分別利用帶葉柄和腋芽的葉片、縱切后留有傷口的葉片以及帶腋芽的莖段進(jìn)行豆瓣綠的扦插研究；趙蘭枝等[14]利用豆瓣綠頂端枝條，在不同的營養(yǎng)液和添加不同濃度3-IBA 的溶液中進(jìn)行了水培繁殖實(shí)驗；王濤等[15]分別用具芽莖段、花序和葉片為外植體，建立了豆瓣綠的組織培養(yǎng)體系；蘇平[16]利用豆瓣綠的頂芽，切取莖尖作為外植體，進(jìn)行了豆瓣綠脫毒苗的培育。目前為止，豆瓣綠的組培體系已經(jīng)相對完備，但由于成本和技術(shù)要求過高，難以應(yīng)用于大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)，組培苗馴化移栽無法成活等問題也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。瓶外生根作為一種新興的生根方式，具有較大的發(fā)展?jié)摿?，我們在現(xiàn)有的組培體系基礎(chǔ)上，將瓶外生根應(yīng)用于豆瓣綠的繁殖過程中，添加三種植物生長調(diào)節(jié)劑，進(jìn)行瓶內(nèi)生根和瓶外生根的比較研究，并對生根率、生根數(shù)目、根長、移栽成活率等指標(biāo)進(jìn)行測定，更加直觀的比較瓶內(nèi)生根與瓶外生根兩種生根方式的效果差異，為豆瓣綠的商業(yè)化繁殖提供更詳細(xì)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 無菌苗的培養(yǎng)

1.1.1 外植體消毒。 實(shí)驗用豆瓣綠（Peperomia tetraphylla (Forst. f.) Hook. et Arn.）種植在曲阜師范大學(xué)溫室中，選擇健康鮮活的葉片為外植體，用軟毛刷清除表面的浮土，再用稀釋過的洗潔精水浸泡40 min，之后用自來水沖洗1 h。然后用75%的乙醇消毒30 s 后用無菌水沖洗3～5 次。最后，使用0.1%升汞溶液添加少量的吐溫-20 進(jìn)行消毒，時間為6 min，并用無菌水再次沖洗3～5 次。

1.1.2 外植體接種和不定芽獲取。在前人的基礎(chǔ)上，我們使用添加1.0 mg/L 6- 芐氨基腺嘌呤（6-BA）和1.0 mg/L 激動素（Kinetin, KT）的MS 培養(yǎng)基進(jìn)行初代培養(yǎng)。培養(yǎng)6 周后，將葉邊緣誘導(dǎo)出的不定芽接種在添加有1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.05 mg/L 赤霉素（gibberellins, GA3）的MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2 生根階段

1.2.1 瓶內(nèi)生根。在MS 培養(yǎng)基中分別添加0.1、0.2、0.3 mg/L 的吲哚丁酸（indolebutyric acid, IBA），萘乙酸（naphthylacetic acid, NAA），2,4- 二 氯 苯 氧 乙 酸（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D）三種植物生長調(diào)節(jié)劑（表1）。每培養(yǎng)瓶中接種3個不定芽，每個處理5 瓶，重復(fù)3 次。

表1 不同濃度IBA，NAA，2,4-D 對豆瓣綠瓶內(nèi)生根的影響

1.2.2 瓶外生根。培養(yǎng)后的試管苗從培養(yǎng)瓶中取出并切割成1～2 cm 至少保留半片葉子的小芽，盡量保證小芽的初始生長狀態(tài)基本一致。然后，使用無菌水浸泡1 h后，在分別添加50、100 和200 mg/L IBA，NAA 和2,4-D的溶液中浸泡30 min，蒸餾水對照，然后將小芽插入蛭石：珍珠巖：泥炭（1：1：2）的混合基質(zhì)中，使用7 cm×7 cm×7 cm 的塑料花盆，每盆3個小芽，每個處理5盆，重復(fù)3 次。每天進(jìn)行一次澆水并在植物上方覆蓋透明塑料蓋子保持水分，5 周后，蓋子以每天2、4、6 和8 h的時間梯度打開，第6 周去掉蓋子再培養(yǎng)3 d。

1.3 培養(yǎng)條件和數(shù)據(jù)處理

培養(yǎng)基中均添加了30 mg/L 蔗糖，6.5 mg/L 瓊脂，并將pH 調(diào)節(jié)到5.8～5.9。實(shí)驗所涉及到的金屬器械、玻璃器皿、培養(yǎng)基等經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌15 min 備用。

所有的植物放在25±1℃的培養(yǎng)室中，光照強(qiáng)度40～50 μmol/m2s PPFD，每天12 h 光照（燈管型號為：飛利浦40 W 燈管，NVC 照明，中國，惠州）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

培養(yǎng)6 周后，使用Microsoft Excel 2007 記錄各處理的生根率，生根系數(shù)，根長以及整體生長狀態(tài)，馴化移栽后，統(tǒng)計移栽成活率。數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行方差分析，均值采用Duncan's 檢驗進(jìn)行多重比較。

2 實(shí)驗結(jié)果

2.1 無菌苗的培養(yǎng)

把消毒后的葉片切成1 cm2左右大小，并接種在添加有1.0 mg/L 6-BA 和1.0 mg/L KT 的MS 培養(yǎng)基中[15]，培養(yǎng)6 周后葉片邊緣誘導(dǎo)出大量的不定芽（圖1A）。繼代培養(yǎng)后，發(fā)育成完整的植株（圖1B）。

2.2 IBA，NAA，2,4-D 對瓶內(nèi)生根的影響

瓶內(nèi)生根的所有處理均可達(dá)到100%的根誘導(dǎo)率（圖2A），但是不同處理間根系的生長特征出現(xiàn)了明顯的不同（表1）。結(jié)果表明，在添加IBA 的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的根細(xì)長，分支多，并有少量根毛（圖2C），在添加NAA 的培養(yǎng)基中生長的根相對較短，但主根上具許多細(xì)小分支（圖2D），在添加2,4-D 的培養(yǎng)基中生長出少量肉質(zhì)短根，根毛濃密（圖2E）。在瓶內(nèi)生根中，在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的IBA 誘導(dǎo)根的長度較長且差異不大，0.1 mg/L IBA 達(dá)到了35.5 mm 的平均根長，且培養(yǎng)出的植株生長狀態(tài)良好，移栽后全部成活，0.3 mg·L-1IBA 可以達(dá)到50.9 的平均生根數(shù)目。綜合來看，0.1 mg/L IBA 在豆瓣綠的瓶內(nèi)生根中效果最佳（表1，圖2A）。經(jīng)過馴化移栽以后，瓶內(nèi)生根小苗的綜合成活率為73.1%（圖2B）。

圖1 豆瓣綠葉片誘導(dǎo)不定芽的形成過程

圖2 不同濃度IBA，NAA，2,4-D 對豆瓣綠瓶內(nèi)生根的影響

2.3 IBA，NAA，2,4-D 對瓶外生根的影響

瓶外生根的小苗，根系均為纖維狀的須根（圖3B）。瓶外生根過程中，IBA 處理過植株的根系生長的更加健康并且有著更多的分枝，而對照中，植株只能生長出少量細(xì)弱的短根（表2）。經(jīng)過IBA 和NAA 處理的小苗，與對照2,4-D 處理相比，地上部分生長的更加健壯、生命力強(qiáng)（圖3A）。瓶外生根過程中，100 mg/L IBA浸泡30 min 是最有效的處理，可以達(dá)到9.8 的平均生根數(shù)和20.3 mm 的平均根長。瓶外生根后的小苗經(jīng)過馴化移栽，成活率可達(dá)100%。

表2 不同濃度IBA，NAA，2,4-D 對豆瓣綠瓶外生根的影響

圖3 不同濃度IBA，NAA，2,4-D 對豆瓣綠瓶外生根的影響

3 討論

3.1 植物激素對豆瓣綠瓶內(nèi)生根的影響

生長素在生根的過程中起著關(guān)鍵作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，IBA 在植物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化成IAA 發(fā)揮作用，從而促進(jìn)根原基的形成、根系的生長和側(cè)根的發(fā)育[18，19]。豆瓣綠在IBA 的處理下可以達(dá)到最佳瓶內(nèi)生根效果，這與前人在馬 大 雜 種 相 思 （Acacia mangium ×A.auriculiformis hybrids）、雜種藍(lán)莓（Wild×'Blomidon'）等植物中的研究結(jié)果一致[20，21]。研究發(fā)現(xiàn)，通常植物會改變他們的根毛和根的直徑等形態(tài)特征以適應(yīng)不同的生長環(huán)境[22]。瓶內(nèi)生根的豆瓣綠植株與瓶外生根相比，具有根系肉質(zhì)、根毛更濃密等特點(diǎn)，這可能和試管內(nèi)特殊的營養(yǎng)條件與微環(huán)境有關(guān)。

3.2 植物激素對豆瓣綠瓶外生根的影響

在瓶外生根過程中，使用100 mg/L IBA 浸泡30 min達(dá)到了良好的生根效果。在爬山虎（Parthenocissus tricuspidata）的研究中發(fā)現(xiàn)，IBA 和NAA 可以促進(jìn)爬山虎根系的生長并使其根系有更多的分支[23]。在杉木（Cunninghamia lanceolata）的瓶外生根研究中100 mg/L IBA 溶液浸泡1 h 效果最佳，生根率可達(dá)89.6%[24]。在蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）的瓶外生根研究中，使用含不同濃度IBA 和NAA 的培養(yǎng)液對不同品種的蝴蝶蘭進(jìn)行瓶外生根培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在添加100 mg/L IBA 的培養(yǎng)液中，生根率可達(dá)95%[25]。在石榴（Punica granatum）的研究中發(fā)現(xiàn)，使用1476 μM/L IBA 處理不定芽的基部5 min 可以達(dá)到85%的生根率[26]。此外，在甘蔗（Saccharum officinarum）的研究中發(fā)現(xiàn)，瓶外生根與瓶內(nèi)生根相比，能夠節(jié)省51%的單株成本[27]。研究發(fā)現(xiàn)，使用瓶外生根的方式培育10000 株馬大雜種相思小苗增加收益1288.26 元[20]。

3.3 豆瓣綠瓶內(nèi)生根和瓶外生根的比較

從我們的研究結(jié)果來看，瓶內(nèi)生根得到的根系質(zhì)量更高，整體生根率可達(dá)100%，經(jīng)過馴化移栽后，瓶內(nèi)生根的成活率為73.1%；瓶外生根的生根率為95.9%，生根后的植株均能成活，總體而言，瓶外生根的成活率要高于瓶內(nèi)生根。主要原因是瓶內(nèi)生長環(huán)境具有無菌、恒溫、高濕的培養(yǎng)特點(diǎn)，試管苗移栽后不能立即適應(yīng)外界的栽培環(huán)境，而瓶外生根中，生長狀態(tài)不佳的弱苗在生根過程中逐漸淘汰，移栽成活的小苗已逐步適應(yīng)了土壤環(huán)境[17，28]。在我們的研究中，瓶內(nèi)生根的小苗生根數(shù)目較多，根系較長，多長有白色根毛，但除IBA 處理生根的小苗外，整體的根系質(zhì)量不高，移栽成活率較低，其中經(jīng)過不同濃度2,4-D 處理后的小苗，綜合成活率僅為43.7%，原因可能是2,4-D 誘導(dǎo)出的肉質(zhì)短根本身含水量過高，難以適應(yīng)土壤中更加復(fù)雜的營養(yǎng)環(huán)境，我們推測這種肉質(zhì)、增粗的變態(tài)短根，其解剖結(jié)構(gòu)已發(fā)生了相應(yīng)的變化，瓶外生根可以減少在馴化移栽時造成的損失，更加適合于豆瓣綠的商業(yè)化生產(chǎn)。目前來講，豆瓣綠的主要繁殖方式為扦插繁殖和組織培養(yǎng)。扦插生根可以節(jié)省人力、物力，但通常繁殖周期過長，繁殖過程易受季節(jié)和母株限制，繁殖系數(shù)低，這種繁殖方式往往不能提供足夠多的植株。組織培養(yǎng)技術(shù)可以快速地繁殖大量植株，其中，瓶內(nèi)生根與后期的移栽是組培的關(guān)鍵因素，也是組培苗商業(yè)化育苗的重要環(huán)節(jié)，但瓶內(nèi)生根通常會面臨成本和操作要求過高、馴化移栽的成活率較低等問題，并不能應(yīng)用于所有的植物[29-32，13，17，24]。而瓶外生根技術(shù)將組織培養(yǎng)技術(shù)和扦插生根進(jìn)行結(jié)合，即將組培得到的大量不定芽進(jìn)行扦插，使植物自養(yǎng)生根，簡化了組培瓶內(nèi)生根程序，降低了操作要求，不僅縮短了育苗周期，降低成本，節(jié)省資源，而且提高了移栽成活率，具有很大的發(fā)展?jié)撃埽档迷诮M培商業(yè)化育苗生根過程中進(jìn)行推廣[17，26，33，34]。