山西省枸杞葉斑病病原鑒定及其生物學(xué)特征

路媛媛，宋艷波，李麗，喬永剛，劉振宇

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷030801）

枸杞（Lyciumspp.），茄科（Solanaceae），枸杞屬（LyciumL.），主要分布在寧夏、青海、甘肅、內(nèi)蒙古等地區(qū)［1］，其果和根皮均可入藥，具有滋補(bǔ)、補(bǔ)精等作用［2］，常用于食品及藥品等。近些年來，隨著國內(nèi)外對枸杞的需求量的增加，我國枸杞的種植面積增加，枸杞的病害隨之增加，嚴(yán)重影響枸杞的品質(zhì)和產(chǎn)量，給當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)造成了巨大的損失［3］。

枸杞的病害種類較多［4］。枸杞根部病害主要由鐮刀菌（Fusariumspp.）引起的枸杞根腐病，發(fā)病時(shí)根部變黑、腐爛，嚴(yán)重時(shí)全株枯萎死亡［5，6］。葉部病害主要為枸杞白粉病、枸杞炭疽病和枸杞灰斑病。枸杞炭疽病主要由紅斑盤長孢菌（Gloeosporium rufomaculans（Berk）Thum）侵染花器引起，隨著發(fā)病時(shí)間延長，進(jìn)而產(chǎn)生黑斑，因此該病害又稱為“枸杞黑果病”［7，8］。由多孢穆氏節(jié)殼菌引起的枸杞白粉病，使枸杞葉片上形成一層白色粉狀霉層［9，10］。枸杞灰斑病由尾孢屬（Cercospora Lyciiell.et Halst）引起，葉片上出現(xiàn)灰白色圓形病斑，邊緣褐色，另外葉背面出現(xiàn)黑色霉?fàn)钗铮?1］。迄今為止，我國關(guān)于枸杞病害的研究大多集中在病害的發(fā)現(xiàn)和病原菌鑒定等方面，有關(guān)病原菌菌絲生長、孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢量等相關(guān)生物學(xué)特征的研究報(bào)道較少，這些制約著病害防治策略的制定及病害的防控。

2019年9月，本課題組在山西太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥實(shí)習(xí)基地發(fā)現(xiàn)一種枸杞葉斑病。調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，該病害的發(fā)病率約為53%，病害侵染初期，病斑形狀不規(guī)則，淡黃色，隨著侵染時(shí)期延長，病斑擴(kuò)展為近圓形，深黃色至棕色，有褐色暈圈，病健交界處明顯。嚴(yán)重時(shí)，病斑可破碎，穿孔，脫落，與現(xiàn)有枸杞葉部病害癥狀不一致。因此為了深入研究該病害，本研究通過癥狀描述，對病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并結(jié)合柯赫氏法則驗(yàn)證，明確引起該病害的病原菌，并對該病原菌菌絲生長、孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢量等相關(guān)生物學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，尋找到病原菌對環(huán)境和營養(yǎng)條件的要求，旨在為進(jìn)一步了解病害的發(fā)病規(guī)律及防治研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年9月，在山西省太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥實(shí)習(xí)基地采集枸杞葉斑病典型癥狀葉片。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離與鑒定

采用組織分離法［12］對枸杞葉斑病病原菌進(jìn)行分離。將葉片病健交界處剪成1 cm×0.5 cm的小塊，升汞（0.1%）30 s，75%酒精消毒1 min，無菌水沖洗3遍，放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中，25℃，培養(yǎng)2～3 d，待病健交界處長出病原菌后，取少量菌絲，放置于新的PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)。待5～7 d產(chǎn)孢后，進(jìn)行單孢純化，4℃保存，備用。

1.2.2 赫氏法則證病

對健康枸杞葉片表面進(jìn)行消毒（75%酒精），將配置好的孢子懸浮液（濃度為1×107個(gè)·mL-1）進(jìn)行噴霧接種，每10個(gè)葉片噴灑2 mL，對照組噴施無菌水［13］。25℃，6-BA保濕培養(yǎng)2～3 d，7 d后觀察葉片發(fā)病情況。當(dāng)人工接種葉片出現(xiàn)癥狀后，重新進(jìn)行組織分離（方法同1.2），比對2次分離所得到的病原菌。

1.2.3 病原菌鑒定

利用光學(xué)顯微鏡觀察病原菌分子孢子、分生孢子梗等大小和形態(tài)，結(jié)合病原菌菌落形態(tài)，依照Zhang［14］和Ellis［15］對 所 分 離 得 到 的 病 原 菌 進(jìn) 行 鑒定。采用尿素法［13］提取病原菌DNA，利用通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）［16］（生工生物工程（上海）股份有限公司合成）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測序結(jié)果利用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，對病原菌進(jìn)行分子鑒定，最后利用Mega5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 不同因素對菌絲生長及孢子形成的影響

（1）營養(yǎng)條件對菌絲生長及孢子形成的影響

不同碳、氮源培養(yǎng)基的制備：以查氏培養(yǎng)基（NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·

7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂粉16 g，蒸餾水1 L）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將KNO3，（NH4）2SO4，蛋白胨，脲，苯丙氨酸，甘氨酸等量替換培養(yǎng)基中的NaNO3，制備成不同氮源的培養(yǎng)基。將可溶淀粉、D-甘露醇、果糖、木糖、葡萄糖等量替換培養(yǎng)基中的蔗糖，制備成不同碳源的培養(yǎng)基。

菌絲生長測定方法：取菌餅（直徑9 mm），移植待測培養(yǎng)基中央后，置于25℃恒溫培養(yǎng)，從第2天起，采用十字交叉法測定菌落直徑，每組重復(fù)3次。

產(chǎn)孢量測定：將培養(yǎng)在不同培養(yǎng)基上的病原菌25℃培養(yǎng)7 d后，用等量（10 mL）無菌水進(jìn)行沖洗，擦凈紙過濾，用血球計(jì)數(shù)板測產(chǎn)孢量，每個(gè)處理重復(fù)10次。

（2）環(huán)境條件對菌絲生長及孢子形成的影響

用HCl（1 mol·L-1和0.1 mol·L-1），NaOH（1 mol·L-1和0.1 mol·L-1）調(diào)節(jié)PDA的pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。取菌餅（直徑9 mm），移植不同梯度pH的PDA培養(yǎng)基中央后，25℃恒溫培養(yǎng)。

光照：取菌餅（直徑9 mm），移植PDA培養(yǎng)基中央后，分別置于全光照，全黑暗和光暗交替（12 h/12 h）條件下，25℃恒溫培養(yǎng)。

菌絲生長測定方法和產(chǎn)孢量測定方法同1.2.4（1）。

1.2.5 不同因素對病原菌孢子萌發(fā)的影響

（1）營養(yǎng)條件對病原菌孢子萌發(fā)的影響

將上述不同碳源或氮源配制成濃度為1%的營養(yǎng)液。用上述營養(yǎng)液配制成濃度為1×108個(gè)·mL-1的孢子懸浮液，采用懸滴法，25℃恒溫培養(yǎng)孢子，經(jīng)預(yù)備試驗(yàn)后，測定6 h孢子萌發(fā)率，每次觀察100個(gè)，重復(fù)3次。

（2）環(huán)境條件對病原菌孢子萌發(fā)的影響

用HCl（1 mol·L-1和0.1 mol·L-1），NaOH（1 mol·L-1和0.1 mol·L-1）將 無 菌 水 調(diào) 節(jié)pH梯 度 為3.0～11.0，間隔為1。用上述梯度溶液配制成濃度為1×108個(gè)·mL-1的孢子懸浮液，孢子萌發(fā)率測定方法同1.2.5（1）。

將無菌水配制成孢子懸浮液（濃度1×108個(gè)·mL-1），利用懸滴法25℃培養(yǎng)孢子，玻片置于全光照、黑暗、光暗交替（12 h）條件下，孢子萌發(fā)率測定方法同1.2.5（1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件對測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀描述

田間調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，該病害的發(fā)病率約53%，田間主要危害葉片，病害侵染初期，病斑形狀不規(guī)則，淡黃色，隨著侵染時(shí)期延長，病斑擴(kuò)展為近圓形，深黃色至棕色，有褐色暈圈，病健交界處明顯。嚴(yán)重時(shí)，病斑可破碎，穿孔，脫落（圖1A）。

2.2 病原菌分離和致病性分析

經(jīng)組織分離法獲得1份病原菌分離物，命名為GQ-1。經(jīng)過噴霧法接種健康的枸杞葉片，離體葉片接種2～3 d后葉片出現(xiàn)淡黃色病斑，4～5 d后出現(xiàn)典型病斑，7 d后病斑逐漸擴(kuò)大，呈近圓形，褐色，有棕色暈圈，病健交界處明顯，對照不發(fā)?。▓D1B）。人工接種出現(xiàn)的病斑癥狀與田間調(diào)查癥狀一致，病葉重新進(jìn)行組織分離后，獲得了同自然發(fā)病一致的病原菌，因此確定該病原菌為引起枸杞葉斑病致病菌。

圖1 枸杞葉斑病發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of Lycium leaf spot

2.3 原菌鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)柯赫氏確定的病原菌，在PDA上的菌落起初為灰白色，菌落稀疏，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌落顏色變?yōu)槟G色至黑褐色，絨毛狀，致密（圖2A）。顯微觀察（圖2B）病原菌孢子倒棍棒狀，褐色，有4～7個(gè)橫隔膜，2～4個(gè)縱隔膜，20.0～44.5 μm×7.5～13μm。

2.3.2 病原菌分子鑒定結(jié)果

以JQ-1的DNA為模板，使用通用引物（ITS1/ITS4）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約512 bp大小的片段（圖3），將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測序，得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中及進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明GQ-1與Alternaria tenuissima（登錄號：MH856117.1）的同源性為100%。利用Mage 5.0，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，GQ-1與A.tenuissima聚為一類，親緣關(guān)系較近（圖4）。因此根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)果表明，待測菌株GQ-1為細(xì)極鏈格孢A.tenuissima。

圖2 枸杞葉斑病病原菌形態(tài)Fig.2 Morphological characteristics of GQ-1

圖3 病原菌的ITS PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR product of ITS

2.4 不同因素對病原菌的生長速率和產(chǎn)孢量的影響

2.4.1 不同碳源對病原菌生長速率及產(chǎn)孢量的影響

由表1可以看出，A.tenuissima可在不同碳源的培養(yǎng)基上生長，但病原菌的生長速率和產(chǎn)孢量差異顯著（P＜0.05）。甘露醇作為碳源時(shí)，病原菌生長最快，平均生長速率為9.67 mm·d-1，其次為葡萄糖、蔗糖、果糖和木糖，在可溶性淀粉中生長最慢。對于產(chǎn)孢，葡萄糖和蔗糖為碳源時(shí)，對產(chǎn)孢較好，分別為2.75×106個(gè)·mL-1和2.20×106個(gè)·mL-1，其次為果糖、木糖和甘露醇，可溶性淀粉不利于病原菌產(chǎn)孢。以上結(jié)果表明，病原菌產(chǎn)孢和生長之間沒有明顯的相關(guān)性。

表1 不同碳源對A.tenuissima菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Table 1 Effect of different carbon sources on mycelium growth and conidiation of A.tenuissima

2.4.2 不同氮源對病原菌生長速率及產(chǎn)孢量的影響

圖4 病原菌系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of GQ-1

A.tenuissima可在不同氮源的培養(yǎng)基上生長，但其生長速率和產(chǎn)孢量存在明顯差異（P＜0.05）（表2）。培養(yǎng)基中加入KNO3時(shí)，病原菌平均生長速率可達(dá)8.43 mm·d-1，有利于菌絲生長，其次為NaNO3、蛋白胨、脲、甘氨酸和苯丙氨酸，當(dāng)添加（NH4）2SO4時(shí)，不利于病原菌菌絲生長，生長速率最慢。雖然（NH4）2SO4對A.tenuissima菌絲生長不利，但最有利于產(chǎn)孢，為2.05×106個(gè)·mL-1，其次為NaNO3、蛋白胨、苯丙氨酸、甘氨酸和KNO3，而在脲中不產(chǎn)孢，這說明病原菌無法利用脲這一氮源進(jìn)行產(chǎn)孢。

表2 不同氮源對A.tenuissima菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on mycelium growth and conidiation of A.tenuissima

2.4.3 不同pH對病原菌生長速率以及產(chǎn)孢量的影響

不同pH值對A.tenuissima生長及產(chǎn)孢有一定的影響（表3）。當(dāng)pH為3.0～11.0時(shí)，GQ-1均可生長，但GQ-1的生長速率和產(chǎn)孢均存在明顯差異。在pH為3.0～7.0時(shí)，菌絲生長速率和產(chǎn)孢量隨著pH的增加而增加，pH為7.0時(shí)，生長速率和產(chǎn)孢量達(dá)到最高值，分別為8.43 mm·d-1和2.33×106個(gè)·mL-1，為A.tenuissima生長及產(chǎn)孢的最適pH值。當(dāng)pH為8.0～11.0時(shí)，菌絲生長速率和產(chǎn)孢量隨著pH的增加而下降。

2.4.4 不同光照對病原菌生長速率及產(chǎn)孢量的影響

在光暗交替（12 h/12 h）條件下，A.tenuissima生長速率和產(chǎn)孢量均為最大值，分別為8.14 mm·d-1和2.42×106個(gè)·mL-1。在全光照和全黑暗條件下，對A.tenuissima生長速率和產(chǎn)孢量的增加促進(jìn)不顯著（表4）。

表3 不同pH對A.tenuissima菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Table 3 Effect of different pH on mycelium growth and conidiation of A.tenuissima

表4 不同光照條件對A.tenuissima菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Table 4 Effect of different light on mycelium growth and conidiation of A.tenuissima

2.5 不同因素對病原菌孢子萌發(fā)的影響

2.5.1 碳源對病原菌孢子萌發(fā)的影響

采用懸滴法對A.tenuissima孢子萌發(fā)率進(jìn)行測定，結(jié)果表明，不同碳源的營養(yǎng)液對A.tenuissima的孢子萌發(fā)存在顯著差異（圖5），其中葡萄糖和蔗糖作為營養(yǎng)液進(jìn)行孢子萌發(fā)時(shí)，孢子萌發(fā)率均能達(dá)到88%以上，為最適碳源；其次為木糖、果糖、甘露醇，孢子萌發(fā)率也在55%以上；另外使用可溶性淀粉作為培養(yǎng)液時(shí)，孢子萌發(fā)率最低，僅為28.67%。

圖5 不同碳源對A.tenuissima分生孢子萌發(fā)的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on conidium germination of A.tenuissima

2.5.2 氮源對病原菌孢子萌發(fā)的影響

不同氮源培養(yǎng)液對A.tenuissim孢子萌發(fā)測定結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，不同氮源培養(yǎng)液對A.tenuissim孢子萌發(fā)的影響存在顯著差異，其中，（NH4）2SO4和NaNO3有 利 于GQ-1的 孢 子 萌發(fā)，萌發(fā)率能達(dá)到88%以上，其次為KNO3和甘氨酸，病原菌的孢子萌發(fā)率仍能達(dá)到75%以上，然而在使用脲、苯丙氨酸作為營養(yǎng)液時(shí)，病原菌的孢子萌發(fā)率在35%左右。使用蛋白胨時(shí)，病原菌的萌發(fā)率最差，僅為19%，這說明蛋白胨對病原菌的孢子萌發(fā)有抑制作用。

2.5.3 pH對病原菌孢子萌發(fā)的影響

pH對A.tenuissim的孢子萌發(fā)影響結(jié)果見圖7。由圖7可見，pH為3.0～11.0時(shí)，隨著pH的增加，A.tenuissim的孢子萌發(fā)率增加，在pH為7.0時(shí)，達(dá)到最高值，為78%。而當(dāng)pH為8.0～11.0時(shí)，隨著pH的增加，A.tenuissim的孢子萌發(fā)率開始下降。

2.5.4 光照條件對病原菌孢子萌發(fā)的影響

病原菌孢子萌發(fā)測定結(jié)果表明，不同光照條件對A.tenuissim的孢子萌發(fā)率存在明顯差異，其中光暗交替12 h/12 h更有利于孢子的萌發(fā)，萌發(fā)率高達(dá)91%。全黑暗條件不利于孢子萌發(fā)，孢子萌發(fā)率為78%（圖8）。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)于2019年9月采集枸杞葉斑病病葉，分離純化得到一株菌株JQ-1，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證，確定其為引起枸杞葉斑病的病原菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段，確定該病原菌為細(xì)極鏈格孢（A.tenuissima）。細(xì)極鏈格孢為鏈格孢屬，鏈格孢菌雖主要為枸杞內(nèi)生菌［17］，但同樣能引起枸杞產(chǎn)生病害［18］。已有研究表明，姜海燕［19］在內(nèi)蒙古地區(qū)的枸杞種植區(qū)發(fā)現(xiàn)一種新的葉枯病，其病原菌為細(xì)鏈格孢菌（A.tenuis），劉偉在甘肅枸杞種植基地的“寧夏枸杞”品種上同樣發(fā)現(xiàn)一種枸杞新葉斑病，其病原菌為（A.alternata）［11］。因此，本文將山西省發(fā)現(xiàn)的新病害——枸杞葉斑病的致病菌鑒定為細(xì)極鏈格孢A.tenuissima。

圖6 不同氮源對A.tenuissima分生孢子萌發(fā)的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources on conidium germination of A.tenuissima

圖7 不同pH對A.tenuissima分生孢子萌發(fā)的影響Fig.7 Effect of different pH values on conidium germination of A.tenuissima

圖8 不同光照對A.tenuissima分生孢子萌發(fā)的影響Fig.8 Effect of different light on conidium germination of A.tenuissima

本研究初步確定了枸杞葉斑病病原菌A.tenuissima的生物學(xué)特征，結(jié)果表明，不同營養(yǎng)條件及營養(yǎng)環(huán)境對病原菌的菌絲生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)有顯著的差異，適于病原菌生長的最佳碳源為甘露醇，最佳氮源為KNO3，但有利于產(chǎn)孢的碳源為葡萄糖和蔗糖，氮源為硫酸銨。對于孢子萌發(fā)測定，最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為硫酸銨和KNO3，這與孟婷婷［20］、魯海菊［21］等的研究結(jié)果有一致的情況，也有不一致的情況，導(dǎo)致這種差異的原因可能與病原菌的寄主不同有關(guān)。孟婷婷［20］在研究樹莓莖潰瘍病病原菌生長和產(chǎn)孢時(shí)表明，最佳氮源為硝酸銨，但本文結(jié)果為硫酸銨，這與魯海菊［21］的研究結(jié)果一致。由于A.tenuissima可利用多種碳源和氮源進(jìn)行生長和產(chǎn)孢，因此在田間栽培的過程中，對于氮肥的使用要慎重。

已有研究表明，細(xì)極鏈格孢在梨［22］、冬棗［23］、櫻桃［24］等果樹上均有發(fā)生，由此可以看出，細(xì)極鏈格孢的寄主范圍較廣，侵染能力強(qiáng)，危害程度大，在不同作物、糧食及果蔬之間相互感染等特點(diǎn)，因此田間處理病殘?bào)w，切斷病原菌初侵染源對于病原菌的防治有著重要的作用。另外，進(jìn)一步開展病害的預(yù)測預(yù)報(bào)，常用藥劑的田間試驗(yàn)等，對有效控制枸杞葉斑病的擴(kuò)大具有一定的指導(dǎo)意義。同時(shí)開展病原菌的致病機(jī)理研究，對病害的進(jìn)一步研究具有一定的意義。