利用SRAP分子標(biāo)記研究山西省野生山丹的遺傳多樣性

王晶，李建，史根生，郝華正，冀中銳，邢國(guó)明

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 經(jīng)濟(jì)作物研究所，山西 汾陽(yáng)，032200；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷，030801）

山丹（Lilium pumilumDC.），又名細(xì)葉百合，為百合科百合屬多年生草本植物。山丹花色鮮艷，株型秀麗，具有較高觀賞價(jià)值。同時(shí)，野生山丹具有較強(qiáng)的莖腐病和葉枯病抗性，是我國(guó)百合育種和品種改良的重要基因資源。

以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)在植物 遺 傳 多 樣 性 研 究［1～5］、品 種 鑒 定［6～8］、系 統(tǒng) 分類［9～12］、農(nóng)藝性狀定位［13～17］等方面具有廣泛應(yīng)用。關(guān)于利用分子標(biāo)記研究山丹遺傳多樣性的報(bào)道較少，Yamagishi［18］用ARPD標(biāo) 記 對(duì)百 合 屬 植 物 進(jìn) 行了種間鑒定；劉冬云［19］通過(guò)SSR標(biāo)記對(duì)北京等13個(gè)省市及河北多地山丹進(jìn)行了種質(zhì)資源差異研究；李晶［20］利用ISSR標(biāo)記對(duì)北京、河北、遼寧、內(nèi)蒙等北方地區(qū)的山丹和百合進(jìn)行了遺傳多樣性研究；郝凱凱［21］利用ISSR標(biāo)記探索了延安地區(qū)野生山丹種質(zhì)的遺傳多樣性。然而，關(guān)于山西省境內(nèi)山丹種質(zhì)遺傳多樣性的研究少見(jiàn)報(bào)道。本研究利用24組SRAP分子標(biāo)記對(duì)山西省境內(nèi)13個(gè)地區(qū)的16份山丹種質(zhì)進(jìn)行了基因型鑒定與遺傳多樣性分析，旨在探索山西省境內(nèi)山丹種質(zhì)的遺傳多樣性，為山丹種質(zhì)資源鑒定與保護(hù)、育種應(yīng)用和分子機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在山西省13個(gè)植被資源豐富的地區(qū)采集了16份山丹種質(zhì)作為供試材料，采集地點(diǎn)分別是芮城縣百梯山、沁水縣歷山、陵川縣王莽嶺、陵川縣黃圍山、太谷縣窯子頭、交城縣龐泉溝、寧武縣蘆芽山、五臺(tái)縣五臺(tái)山、平魯縣大草坪和大同市七峰山、大同市采涼山、天鎮(zhèn)縣林場(chǎng)、渾源縣恒山地區(qū)。各采集點(diǎn)地理信息見(jiàn)表1，16份山丹供試樣品的植物學(xué)特征見(jiàn)表2。

表1 樣品采集地區(qū)地理信息Table 1 Geographic information of sample collection areas

表2 供試樣品的植物學(xué)特征Table 2 Botanical characteristics of samples

1.2 試驗(yàn)方法

山丹基因組總DNA提取采用改良的CTAB法，提取后DNA通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢，并溶于1×TE緩沖液保存于?20℃?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系為20μL，其中10×PCR buffer 5μL（含Mg2+）、2.5 mmol·L-1dNTPs 2μL、5 U·μL-1Taq酶0.3μL、50 ng·μL-1引物各2μL、30 ng·μL-1DNA 1μL、ddH2O 9.7μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋孩?4℃預(yù)變性5 min；②94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸80 s（5個(gè)循環(huán)）；③72℃延伸10 min；④94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸80 s（37個(gè)循環(huán)）；⑤72℃延伸12 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，銀染后拍照保存。PCR buffer、dNTPs、Taq酶均購(gòu)買(mǎi) 于江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司，試驗(yàn)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表3。

表3 SRAP引物序列Table 3 SRAP primer sequences

統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)帶型得到供試樣品的基因型數(shù)據(jù)，利用NTSYSpc-2.0軟件，計(jì)算出16份山丹種質(zhì)的相似系數(shù)矩陣。SRAP分子標(biāo)記為顯性標(biāo)記，因此將基因型的有無(wú)轉(zhuǎn)化為數(shù)字1和0，形成每個(gè)樣本的數(shù)字指紋圖譜，便于統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提 取與PCR產(chǎn)物 檢測(cè)

通過(guò)改良的CTAB法提取的山丹基因組總DNA帶型清晰，無(wú)明顯拖尾，DNA完整性好，可用于后續(xù)基因型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)（圖1a）。在88對(duì)SRAP引物組合中，有24對(duì)組合可以擴(kuò)增出清晰的特異性條帶（表4，圖1b）。

2.2 供試樣品的多態(tài)性分析及指紋圖譜構(gòu)建

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，24對(duì)引物組合共擴(kuò)增出821條條帶，每對(duì)引物可擴(kuò)增出21～52條清晰條帶，多態(tài)性條帶17～47條，多態(tài)性比率為70%～90.4%，鑒別能力在31.25%～100%。平均每對(duì)引物擴(kuò)增出34.2個(gè)條帶。其中，引物組合Me-7/Em-5的多態(tài)性較好，可區(qū)分全部16份山丹樣品。24對(duì)引物組合所擴(kuò)增的條帶數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)、比率和鑒別能力見(jiàn)表4。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，將引物組Me-7/Em-5基因型的有無(wú)轉(zhuǎn)化為數(shù)字1和0，形成每個(gè)樣本的數(shù)字指紋圖譜，便于結(jié)果保存與計(jì)算機(jī)識(shí)別分析（表5）。

表5 引物組Me-7/Em-5在16份山丹種質(zhì)中的指紋圖譜Table 5 Fingerprinting of sixteen Lilium pumilum germplasms amplified by Me-7/Em-5 primer pairs

續(xù)表

2.3 遺傳多樣性分析

利用NTSYS2pc2.0軟件，采用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建出遺傳距離關(guān)系樹(shù)狀圖。16份山丹種質(zhì)的Jaccardp’s相似系數(shù)在0.58～0.83之間，在相似系數(shù)為0.61的水平上，可以將供試樣品分為兩大類群。第一類群共13份樣品，包含

圖1 DNA質(zhì)檢和PCR產(chǎn)物凝膠電泳Fig.1 Quality control of DNA and the gel electrophoresis of PCR products

圖2 樣品聚類與樣品采集點(diǎn)Fig.2 Clustering result and the sample collection areas

No.01、No.03、No.05、No.07、No.08、No.09、No.10、No.11、No.12、No.13、No.14、No.15、No.16樣品，第二類群共3個(gè)樣品，包含No.02、No.04、No.06（圖2a）。

在第一類群中，13個(gè)供試樣品又可細(xì)分為4個(gè)小類群。第一小類群為位于山西北部的大同市采涼山、渾源縣恒山、大同市礦區(qū)和天鎮(zhèn)縣林場(chǎng)的4份山丹樣品；第二小類群為位于山西中北部的五臺(tái)縣五臺(tái)山、平魯縣打草坪、寧武縣蘆芽山和交城縣龐泉溝的4份樣品；第三小類群為位于山西南部的陵川縣王莽嶺、黃圍山、沁水縣歷山和芮城縣百梯山的5份山丹樣品；第四小類群為太谷縣窯子頭的1份山丹樣品（圖2b）。

3 討論與結(jié)論

山丹具有豐富的遺傳變異和較強(qiáng)的抗病、抗逆能力，是我國(guó)百合育種和品種改良的重要基因資源。建立有效的分子標(biāo)記，對(duì)加快山丹種質(zhì)資源遺傳分析和百合育種具有重要的理論意義。分子標(biāo)記具有檢測(cè)效率高、不受環(huán)境影響等優(yōu)勢(shì)，正在成為植物品種鑒定與保護(hù)、品種選育、分子機(jī)理研 究 的 強(qiáng) 有 力 工 具［22～24］。本 研 究 通 過(guò) 對(duì)88組SRAP引物進(jìn)行篩選，得到24組多態(tài)性豐富的引物組合，24組引物可分別擴(kuò)增出21～52條清晰條帶，多態(tài)性條帶17～47條，多態(tài)比率為70%～90.4%，鑒別能力31.25%～100%。本研究結(jié)果表明，SRAP分子標(biāo)記可以有效地鑒別山丹種質(zhì)遺傳多樣性，該24對(duì)引物組合為山西省境內(nèi)山丹品種保護(hù)與鑒定、育種應(yīng)用提供了可靠的標(biāo)記基礎(chǔ)。

研究通過(guò)24組SRAP分子標(biāo)記將16份山丹種質(zhì)分為兩大類群，一類群共13份樣品，花色均為橘色，另一類群共3份樣品，花色均為紅色。由此表明，山西省境內(nèi)不同花色間的山丹種質(zhì)遺傳差異性更大。紅色花株型較大，根莖葉和花都明顯比橘色花種質(zhì)的大。橘色花類群山丹種質(zhì)較為豐富，又可分為4個(gè)亞群。采涼山、恒山、天鎮(zhèn)等地均為沙地，生境較差，山丹種質(zhì)的遺傳相似度較高。同樣，生長(zhǎng)于腐葉土環(huán)境的山丹種質(zhì)遺傳相似度也較高，且2種生境的山丹種質(zhì)有較高的遺傳差異性。北部生態(tài)環(huán)境脆弱地區(qū)的種質(zhì)在性狀上與其他種質(zhì)差別很大，不僅發(fā)生了小型化的變化，而且莖葉花薄，部分花發(fā)生不規(guī)則反卷，可見(jiàn)生境差異也是影響山丹種質(zhì)遺傳多樣性的重要因素，同時(shí)也反映出種質(zhì)的抗逆性較強(qiáng)，具有較高的優(yōu)良基因開(kāi)發(fā)潛力。由此可以看出，同一花色內(nèi)山丹種質(zhì)遺傳差異性與山丹種質(zhì)的地理分布和生境條件緊密相關(guān)，同一生境條件下的山丹種質(zhì)遺傳相似度更高。劉冬云［19］對(duì)北京等13個(gè)省市的山丹種質(zhì)的遺傳差異分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)不同生境的山丹種質(zhì)抗尖孢鐮刀菌能力、耐極端氣候能力均有較大差異，從表型到分子水平均表現(xiàn)出較高的遺傳差異性。山丹豐富的遺傳變異和較強(qiáng)的抗病、抗逆能力，都使其成為我國(guó)百合育種的寶貴資源；郝凱凱［21］對(duì)延安野生山丹種質(zhì)遺傳多樣性的研究發(fā)現(xiàn)海拔高度、年日照時(shí)數(shù)、年降水量、氣溫等地理、氣候因子均對(duì)山丹種質(zhì)遺傳多樣性產(chǎn)生影響。綜上，山丹種質(zhì)具有豐富的遺傳多樣性，是寶貴的遺傳改良資源。

表4 SRAP引物擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性信息統(tǒng)計(jì)Table 4 Polymorphism statistics of PCR products amplified from 24 pairs of SRAP primers

山丹是我國(guó)百合育種和品種改良的重要基因資源，建立成熟的分子標(biāo)記體系可促進(jìn)山西省境內(nèi)山丹種質(zhì)的高效利用。本研究表明，SRAP分子標(biāo)記可以有效地鑒別山丹種質(zhì)遺傳多樣性，山西省境內(nèi)不同花色間的山丹種質(zhì)遺傳差異性更大，同一花色內(nèi)的山丹種質(zhì)遺傳相似度與地理分布、生境條件緊密相關(guān)。本研究為山丹種質(zhì)的保護(hù)與鑒別、育種應(yīng)用和分子機(jī)理研究提供了技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。