即食鴨制品大腸埃希菌污染狀況、毒力基因和耐藥特征分析

楊 華，馬 艷，劉秀婷，呂文濤，盧立志，肖英平，*

(1.省部共建農(nóng)產(chǎn)品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室(籌)，浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質量標準研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江正明檢測有限公司，浙江 寧波 315200； 3.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

大腸埃希菌(Escherichiacoli)是革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，在食品衛(wèi)生上常被作為檢測指標，是人和動物腸道中大量分布的一種細菌。大腸埃希菌病作為一種潛在的人獸共患病[1]，有重要的流行病學及公共衛(wèi)生學意義[2]。鴨大腸埃希菌病是指由禽致病性大腸埃希菌(APEC)引起的感染性疾病，在臨床上有大腸埃希菌性敗血癥、呼吸道型大腸埃希菌病、腫頭綜合征、腹膜炎、滑膜炎、腹水癥和鼻竇炎等多種病型[3]。由于大腸埃希菌種類繁多，血清型較復雜，給免疫防治帶來一定的困難，因此，藥物防治是目前控制該病的主要手段[4]。但隨著藥物的大量及不合理使用，加快了大腸埃希菌耐藥性的產(chǎn)生[5]，不僅影響抗菌藥物在獸醫(yī)臨床上的療效，而且其耐藥菌株可通過食物鏈進入人體，對人類的健康安全造成威脅。

對于水禽中大腸埃希菌的研究主要集中于從活禽或者病料中分離獲得大腸埃希菌來開展致病性和耐藥性研究[6-9]，而對于水禽產(chǎn)品如即食鴨制品中大腸埃希菌的毒力基因以及耐藥特征研究甚少。本文旨在研究即食鴨制品中大腸菌群污染情況及分離出的大腸埃希菌的毒力基因和耐藥特征，探討其耐藥基因多態(tài)性和遺傳多樣性，以期為即食食品中耐藥菌株流行病學研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與菌株分離鑒定

分別在浙江、上海、福建、江蘇、廣東、北京、黑龍江、內(nèi)蒙古、貴州、湖北和四川11個省份采集即食鴨制品491份，用于大腸埃希菌的分離。大腸埃希菌的分離方法參照GB 4789.6—2016《食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》進行。采用布魯克microflex MALDI TOF/TOF 質譜儀進行菌株的分離鑒定。

質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 耐藥譜測定

大腸埃希菌的耐藥譜采用梅里埃VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進行測定。測定的抗生素種類如下：青霉素類、頭孢菌素類、單環(huán)β內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類、甘氨酰四環(huán)素類、呋喃類和磺胺類。

1.3 基因組DNA提取

采用煮沸法提取大腸埃希菌基因組DNA，用于PCR反應[10]。

1.4 毒力基因分析

以提取的大腸埃希菌基因組DNA為模板，參照GB 4789.6—2016中大腸埃希菌緊密素基因(gene encoding intimin forEscherichiacoliattaching and effacing，eae)，侵襲性質粒抗原H基因(invasive plasmid antigen H-gene，ipaH)，侵襲性質粒調節(jié)基因(invasive plasmid regulator，invE)，熱不穩(wěn)定性腸毒素基因(heat-labile enterotoxin，lt)，集聚黏附菌毛調節(jié)基因(aggregative adhesive fimbriae regulator，aggR)，腸定植因子基因(protein involved inintestinal colonization，pic)，蛋白分泌物調節(jié)基因(gene encoding LEE-encoded type Ⅲ secretion system factor，escV)，志賀毒素Ⅰ基因(Shiga toxin one，stx1)，志賀毒素Ⅱ基因(Shiga toxin two，stx2)等毒力基因的引物序列(表1)進行PCR擴增，PCR擴增反應程序為95 ℃，5 min預變性；然后94 ℃，30 s，58 ℃，30 s；72 ℃，1 min，共32個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳分析結果。

表1 毒力基因引物Table 1 Virulence gene primers

1.5 耐藥基因分析

從磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素類、氨基糖苷類和多粘菌素類等8類抗生素耐藥基因中共選取了18種典型的耐藥基因進行大腸埃希菌分離株攜帶的耐藥基因分析，參照王佩佩等[11]所用的引物，具體見表2。PCR擴增反應程序為95 ℃，5 min預變性；然后94 ℃，30 s，58 ℃，30 s；72 ℃，1 min，共32個循環(huán)。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析結果。

表2 耐藥基因引物Table 2 Drug resistance gene primers

續(xù)表2 Continued Table 2

針對產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)的大腸埃希菌進行β-內(nèi)酰胺酶基因分析，參照文獻[12]設計引物，具體引物序列見表3。

表3 β-內(nèi)酰胺酶基因引物Table 3 β-lactamase gene primers

1.6 Ⅰ型整合酶基因和Ⅰ型整合子基因盒檢測

以大腸埃希菌基因組DNA為模板，參照文獻[6]所述的引物進行PCR擴增，Ⅰ型整合酶基因(Intl)引物為5′-CCTCCCGCACGATGATC-3′和5′-TCCACGCATCGTCAGGC-3′；Ⅰ型整合子基因盒引物為5′-GGCATCCAAGCAGCAAG-3′和5′-AAGCAGACTTGACCTGA-3′。反應條件為94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；58 °C(Intl)或55 ℃(Ⅰ型整合子基因盒)，30 s；72 ℃，1 min，共30個循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR擴增后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

基因盒插入?yún)^(qū)PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收純化，連接于pMD18-T載體上并轉入感受態(tài)細胞，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，并對測序結果進行BLAST比對分析。

2 結果與分析

2.1 不同地區(qū)大腸埃希菌檢出情況

在全國11個不同省份共采集了491份樣品，其中109份樣品中檢出大腸埃希菌，平均檢出率為22.20%(表4)。

表4 不同地區(qū)大腸埃希菌檢出情況Table 4 Detection percentage of E. coli in different areas

2.2 毒力基因分析

圖1為大腸埃希菌9個毒力基因的檢出率結果。在檢測的9個毒力基因中，毒力基因escV的檢出率最高，達7.34%，其次為pic，為6.42%，ipaH和aggR均為3.67%，stx2為2.75%，eae、lt和stx1均為1.83%，invE基因未檢出。

圖1 大腸埃希菌的毒力基因檢出率Fig.1 Percentage of virulence genes in E.coli

2.3 大腸埃希菌耐藥表型分析

表5為109株大腸埃希菌的17種抗生素的耐藥表型結果。大腸埃希菌對不同類型抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥。其中對于磺胺類中的復方新諾明耐藥性最高，耐藥率高達63.30%，其次為青霉素類中的氨芐西林，耐藥率為61.47%，喹諾酮類中的環(huán)丙沙星為22.94%，氨基糖苷類中的慶大霉素和頭孢菌素類中的頭孢唑啉均為20.18%，頭孢曲松為19.27%，左旋氧氟沙星為18.35%，妥布霉素為11.93%，氨曲南為10.09%，頭孢西丁為3.67%，阿莫西林-棒酸為2.75%，呋喃妥因和頭孢匹美均為1.83%，其余4種(哌拉西林-他唑巴坦、厄他培南、亞氨培南、替加環(huán)素)為0。

圖2為分離的109株大腸埃希菌的多重耐藥分布情況。其中耐藥數(shù)為12和11的菌株比例均為2.75%(3/109，3/109)，耐藥數(shù)≥3的菌株株比例為60.55%(66/109)。

圖2 大腸埃希菌的多重耐藥分布情況Fig.2 Multi-drug resistance of isolated E.coli

2.4 耐藥基因分析

圖3為大腸埃希菌18種耐藥基因的檢出率結果。其中，大腸埃希菌磺胺類藥物耐藥基因sulⅠ和sulⅡ檢出率最高，分別為100%和88.07%，喹諾酮類基因qnrS和qepA，氨基糖苷類耐藥基因aadA1和mecC的檢出率也較高，均在35%以上。

圖3 大腸埃希菌耐藥基因檢出情況Fig.3 Percentage of drug-resistance genes of E.coli

2.5 β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因分析

在109株分離的即食鴨制品大腸埃希菌中，其中24株產(chǎn)ESBLs。為了進一步探析其耐藥基因攜帶情況，采用PCR對所有產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌進行β-內(nèi)酰胺耐藥基因檢測，結果發(fā)現(xiàn)，CTX-M的檢出率為100%(24/24)，TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-9和CTX-M-25的檢出率分別為95.83%(23/24)、4.17%(1/24)、66.67%(16/24)、12.50%(3/24)、75.00%(18/24)和4.17%(1/24)，CTX-M-8未檢出(圖4)。

圖4 ESBLs陽性大腸埃希菌β-內(nèi)酰胺酶基因檢出情況Fig.4 Percentage of β-lactamase drug-resistance genes in ESBLs-positive E.coli

2.6 Ⅰ型整合子和基因盒分析

檢測109株大腸埃希菌的Ⅰ型整合子發(fā)現(xiàn)20株為Ⅰ型整合子陽性，檢出率為18.35%。對20株Ⅰ型整合子陽性大腸埃希菌基因盒擴增產(chǎn)物電泳分析發(fā)現(xiàn)，7株攜帶3種不同大小基因盒插入片段，其中2株大腸埃希菌Ⅰ型整合子基因盒插入的為dfrA1-aadA1，4株為dfrA12-aadA2，另1株為aadA22。

3 討論

大腸埃希菌的致病性是由多種毒力因子共同作用的結果，這些毒力因子之間相互協(xié)調，破壞宿主的防御系統(tǒng)，進而引起炎癥反應。其中，腸定植因子基因pic使大腸埃希菌黏附于宿主腸粘膜而不被腸蠕動和腸分泌液所清除，是大腸埃希菌致病的首要因素[13]。本研究中即食鴨制品大腸埃希菌的毒力基因分析發(fā)現(xiàn)，毒力基因escV的檢出率最高，其次為pic，ipaH、aggR、stx2、eae、lt和stx1也均有檢出，說明即食鴨制品攜帶大腸埃希菌具有一定潛在的致病性。

本研究中分離的109株大腸埃希菌的耐藥表型表明，分離株對復方新諾明、氨芐西林的耐藥性最高，耐藥率高達60%以上，對環(huán)丙沙星、慶大霉素、頭孢唑啉耐藥性較高，對頭孢曲松、左旋氧氟沙星和妥布霉素等抗生素敏感，這些結果與趙燕等[6]和Soufi等[14]從活禽肉中分離出來的大腸埃希菌耐藥表型較為一致。而鄧伯雄等[15]通過對鴨致病性大腸埃希菌耐藥研究后認為，較為敏感的環(huán)丙沙星和左旋氧氟沙星可以選擇作為鴨場的首選藥物，與本結果相悖，可能與養(yǎng)殖過程中使用藥物情況有關。對于即食鴨制品大腸埃希菌的多重耐藥分布情況，在本試驗中耐藥數(shù)最高為12，菌株比例為2.75%，另外，耐藥數(shù)≥3的菌株比例為60.55%，顯著高于趙燕等[6]從蛋鴨中分離的大腸埃希菌耐藥數(shù)。

ESBLs是一類能水解青霉素類、頭孢菌素類以及單環(huán)類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶，其活性可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制。能產(chǎn)生ESBLs的細菌，對β-內(nèi)酰胺類、頭孢類、青霉素類、氨基糖苷類、磺胺類等多種抗生素耐藥。目前，產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌在美國、法國、加拿大、中國和日本等國家均有報道，尤其是CTX-M型ESBLs傳播較快[16-18]。本試驗即食鴨制品產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌陽性率為22.02%，高于趙燕等[6]和吳華等[19]對活鴨大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs檢出率，低于劉保光等[20]的活鴨大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs檢出率；檢測出的β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因主要是CTX-M、TEM、CTX-M-9和CTX-M-1。

大腸埃希菌主要通過獲得性耐藥產(chǎn)生耐藥，借助于整合子、轉座子和質粒等可移動元件進行耐藥基因的傳播[21]。整合子是含有能夠整合、交換和表達基因盒的位點特異性重組系統(tǒng)的遺傳元件，位于染色體、質?；蜣D座子等可移動元件上，可通過整合酶捕獲或者整合耐藥基因，傳播耐藥基因，介導細菌多重耐藥[7，22-23]。大腸埃希菌中最常見的是Ⅰ型整合子[24]，因此本研究著重分析了Ⅰ型整合子的攜帶狀況，發(fā)現(xiàn)即食鴨制品大腸埃希菌Ⅰ型整合子的陽性檢出率為18.35%。在不同源的大腸埃希菌分離株中，dfrA1-aadA1是最常監(jiān)測到的基因盒[25]，表明該基因盒在大腸埃希菌中的廣泛選擇和傳播[26]。dfrA編碼二氫葉酸還原酶，該酶能競爭性抑制磺胺類藥物，使細菌對磺胺類藥物耐藥[7]；aadA編碼氨基糖苷腺苷酸轉移酶，對氨基糖苷類藥物關鍵位點具有化學修飾作用，阻斷了藥物與細菌16S rRNA結合，使細菌對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥性[27]。本試驗中7株攜帶Ⅰ型整合子陽性大腸埃希菌含有3種不同大小基因盒插入片段，其中2株大腸埃希菌Ⅰ型整合子基因盒插入的為dfrA1-aadA1，4株為dfrA12-aadA2，另1株為aadA22。結果提示，即食鴨制品中存在一定的大腸埃希菌污染，且部分污染的大腸埃希菌攜帶有毒力基因和具有耐藥性。