草莓種間雜交后代與親本性狀比較

王淑珍，周歷萍，裘劼人，童建新，余 紅，柴偉國，來文國

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310024)

草莓屬(Fragaria)約有25個(gè)種，分屬2x、4x、5x、6x、8x、10x等不同倍性。我國是世界上野生草莓資源最豐富的國家，分布有14個(gè)種，包括9個(gè)二倍體種和5個(gè)四倍體種[1-2]，分布著極有價(jià)值的珍貴類型，如白果類型、抗病類型(黃毛草莓F.nilgerrensis、五葉草莓F.pentaphylla)、芳香類型、抗寒類型(東北草莓F.mandschurica、東方草莓F.orientalis)等[1]。低倍性野生草莓資源具有抗病、抗逆、高芳香性，同時(shí)在高固形物含量、高鈣鉀鐵元素含量和高氨基酸含量等方面也有較高的利用價(jià)值。野生草莓資源的利用是草莓新品種改良的潛力所在，是栽培品種改良的重要遺傳資源[2-4]。目前生產(chǎn)上廣泛栽培的主要是八倍體鳳梨草莓(F.×ananassaDUCH.)。系譜和遺傳多樣性分析表明，草莓種內(nèi)品種間雜交使栽培品種遺傳背景狹窄，抗病性和抗逆性減弱[3]。國內(nèi)外學(xué)者通過草莓種間雜交獲得了具有潛在利用價(jià)值的種間雜交后代材料[1，3，5-7]，例如雷家軍等[1]用栽培品種哈尼(8x)和自然野生草莓黑龍江1號(hào)(5x)雜交，獲得了種間雜種HH-1(6x)；用湯姬(8x)和黑龍江7號(hào)(5x)得到了9x種間雜種[6]、十二倍體種間雜種YH15-10[7]等。這些種間雜交材料的獲得可將野生草莓資源中的優(yōu)良性狀基因向栽培品種轉(zhuǎn)移，豐富了優(yōu)良草莓新品種選育的材料基礎(chǔ)。本研究利用現(xiàn)有8x栽培種鳳梨草莓資源與2x野生草莓資源進(jìn)行種間雜交，通過對(duì)種間雜交后代和父母本的性狀比較研究，評(píng)價(jià)和進(jìn)一步利用種間雜種后代，創(chuàng)制豐富的優(yōu)良育種材料，獲得基因漸滲系。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：2x森林草莓Ruegen (RG)、8x栽培品種紅玉(Hongyu)，RG×紅玉的種間雜交后代6x RH28。材料來源于杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。

1.2 方法

前期試驗(yàn)結(jié)果表明，田間自然條件下RG僅在小蕾期有少量具活力的花藥，其余各階段均未檢測到花藥活力，雌蕊柱頭在大蕾期、開花第1天、開花第2天、開花第3天具弱可授性，其他花期柱頭均不具可授性[2]。種間雜交于2017年2月下旬進(jìn)行，RG×紅玉正反交二組雜交組合，每組合雜交100朵花，同時(shí)對(duì)2個(gè)母本去雄10朵花套袋作為對(duì)照，觀察去雄效果。雜交果實(shí)正常成熟時(shí)調(diào)查雜交結(jié)實(shí)率。采集雜交種子于當(dāng)年5月下旬播種于苗床，當(dāng)幼苗展開3片真葉時(shí)移栽于營養(yǎng)缽，于控溫控濕玻璃大棚中培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)實(shí)生苗出苗率，并進(jìn)行染色體倍性檢測。2017年9月定植于栽培大棚，田間觀察于2017年9月至2018年5月進(jìn)行。

1.3 染色體數(shù)檢測

1.3.1 根尖染色體數(shù)測定

采用1 mol·L-1HCl解離10 min，卡寶品紅染色法觀察根尖染色體數(shù)[5]。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)測定染色體倍性

美國貝克曼Quanta.SC流式細(xì)胞儀檢測染色體倍性，利用隨機(jī)軟件Cell Lab QuantaTM獲取數(shù)據(jù)和直方圖[8]。

1.4 不同倍性草莓植株葉片結(jié)構(gòu)和細(xì)胞厚度測量

參照Solarbio番紅-固綠染色液G1375試劑盒使用說明操作。

染色結(jié)果：細(xì)胞核和木質(zhì)化細(xì)胞壁呈鮮艷的紅色，細(xì)胞質(zhì)和纖維素的細(xì)胞壁呈綠色。

測量與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：番紅-固綠染色片子在200倍或400倍鏡下觀察并拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件分別測量植株葉片上表皮細(xì)胞、柵欄組織細(xì)胞、海綿組織細(xì)胞和下表皮細(xì)胞的直徑，結(jié)果以均值±方差表示。

1.5 花藥活力測定

采用TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色法測定小蕾期、中蕾期、大蕾期、開花第1～5天的花藥活力，顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)有活力的花粉數(shù)目[2]。

1.6 植株性狀觀察與果實(shí)品質(zhì)測定

對(duì)2個(gè)親本和種間雜交后代進(jìn)行田間性狀觀察，采集RG、紅玉、RH28健康成熟果實(shí)，采用ATAGO便攜式固形物含量測定儀進(jìn)行可溶性固形物(TSS)含量測定，采用質(zhì)構(gòu)儀(CT3，美國Brookfield)進(jìn)行硬度測定，測定方法參照文獻(xiàn)[2，9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 去雄結(jié)果

田間調(diào)查結(jié)果表明，去雄套袋的親本RG和紅玉均未得到正常膨大的果實(shí)和種子，說明去雄效果較好。

2.2 種間雜交結(jié)實(shí)與種子出苗情況

RG和紅玉草莓正反種間雜交結(jié)實(shí)和播種實(shí)生苗出苗情況見表1。雜交結(jié)實(shí)率紅玉×RG為15%，低于RG×紅玉的22%；RG×紅玉平均單果獲種子數(shù)為9.8粒，多于紅玉×RG的4.8粒；紅玉×RG的實(shí)生苗出苗率為20.83%，大于RG×紅玉的12.04%。由表2倍性檢測結(jié)果可知，紅玉×RG種間雜交后代倍性高于RG×紅玉，推測倍性低種子出苗較差。

表1 不同倍性草莓種間雜交結(jié)實(shí)和種子出苗情況Table 1 Seed setting and emergence of different ploidy strawberry interspecific hybrids

2.3 種間雜交后代染色體倍性檢測

分別對(duì)46株RG×紅玉實(shí)生苗和15株紅玉×RG實(shí)生苗進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)染色體倍性檢測，RG為CK1，紅玉為CK2，結(jié)果如表2所示。RG×紅玉雜交后代中2x、3x、4x、5x、6x植株占比分別為19.57%、45.65%、19.57%、13.04%、2.17%，4x以下的低倍性實(shí)生苗占了84.79%；紅玉×RG雜交后代3x、4x、5x、6x植株占比分別為20.0%、26.67%、26.67%、26.67%，未檢出2x植株，4x以下的低倍性實(shí)生苗占比46.67%。

采用根尖染色體數(shù)卡寶品紅染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞核DNA相對(duì)含量，對(duì)2個(gè)親本RG、紅玉，以及種間雜交后代RH28植株分別進(jìn)行了染色體倍性檢測。結(jié)果表明，RG根尖染色體數(shù)為14條(2n=2x=14)、細(xì)胞核DNA相對(duì)含量210.7；紅玉根尖染色體數(shù)為56條(2n=8x=56)，細(xì)胞核DNA相對(duì)含量802.3；RH28根尖染色體數(shù)為42條(2n=6x=42)，細(xì)胞核DNA相對(duì)含量612.3(圖1、表2)。

G0/G1，DNA合成前期；S ohase，DNA合成期；G2，DNA合成后期。G0/G1， DNA synthesis prophase; S ohase， DNA synthesis stage; G2， Last stage of DNA synthesis。圖1 不同倍性草莓植株染色體倍性Fig.1 Chromosome ploidy of different ploidy strawberry plants

表2 種間雜交后代倍性流式細(xì)胞檢測結(jié)果Table 2 Test results of flow cytometry on ploidy of interspecific hybrid progeny

續(xù)表2 Continued Table 2

2.4 不同倍性草莓植株性狀比較

2.4.1 葉片組織

用番紅-固綠染色法觀察不同倍性(2x RG、8x紅玉和6x RH28)草莓植株葉片結(jié)構(gòu)，測量各細(xì)胞厚度。由表3、圖2可見，紅玉葉片上表皮厚度為(33.46±4.58)μm，大于RH28和RG，但差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)；紅玉葉片柵欄組織厚度最大，為(10.48±2.11)μm，顯著(P<0.05)大于RH28和RG；紅玉葉片海綿組織厚度為(11.85±1.71)μm，顯著大于RG，RH28葉片海綿組織厚度居中，為(11.04±1.01)μm；紅玉和RH28的葉片下表皮厚度分別為(17.53±2.15)μm和(17.36±1.85)μm，均顯著大于RG。試驗(yàn)結(jié)果表明，葉片組織結(jié)構(gòu)厚度與基因倍性成正比。

圖2 不同倍性植株葉片組織電鏡圖Fig.2 Electron micrograph of leaf tissue of different ploidy plants

表3 不同倍性植株葉片細(xì)胞厚度比較Table 3 Comparison of cell thickness in leaves of different ploidy plants μm

2.4.2 株型、花粉活力、果實(shí)品質(zhì)

從圖3、表4、表5可見，RG植株矮，分枝極多，匍匐莖抽生困難；開花時(shí)花朵小，雄蕊數(shù)少，僅在小蕾期有少量具有活力的花藥，花粉活力為(16.74±3.16)%，其余各階段均未檢測到花粉活力；果實(shí)軟，硬度為59.8 g·cm-2，果實(shí)含水量為83.97%，口感軟綿，種子外凸，TSS含量為11.5%。紅玉植株匍匐莖抽生正常，可通過匍匐莖繁苗保存種源；紅玉花粉活力強(qiáng)且花粉量多，各階段均有一定的花粉活力，在大蕾期和開花第1天達(dá)到高峰，花粉活力分別為(49.41±3.91)%和(57.29±2.33)%；果實(shí)硬度為366.4 g·cm-2，果實(shí)含水量為93.20%，汁水豐富口感好，TSS含量為7.8%。種間雜交后代RH28植株略高于RG，分枝數(shù)少于RG，能抽生少量匍匐莖，可通過匍匐莖繁苗保存種源；花朵大小和雄蕊數(shù)介于2個(gè)親本之間，在花期各階段均能檢測到花粉活力，花粉活力的變化趨勢與紅玉相同，在大蕾期和開花第1天達(dá)到高峰，花粉活力分別為(32.13±4.42)%和(35.92±3.61)%，各階段的花粉活力小于紅玉，但大于RG，這利于后續(xù)用栽培種回交提高雜交成活率；果實(shí)硬度為184.2 g·cm-2，果實(shí)含水量為89.70%，TSS含量為10.4%，種子凸于果面。

表5 不同倍性草莓的果實(shí)硬度、含水量、TSS含量比較Table 5 Hardness， water content and TSS content of different ploidy strawberries

3 結(jié)論與討論

本研究通過不同倍性草莓的種間雜交獲得了5x、6x等不同倍性草莓材料，并對(duì)六倍體種間雜種RH28的植株形態(tài)、品質(zhì)性狀等進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，2x RG和8x紅玉的正反交試驗(yàn)中，RG×紅玉的雜交結(jié)實(shí)率高于紅玉×RG，這與RG作母本時(shí)嚴(yán)格控制授粉時(shí)間在大蕾期至開花第3天，并授予足夠量的父本花粉有關(guān)，而RG作父本時(shí)其花藥僅在小蕾期有弱活性，花粉量少且活性弱導(dǎo)致雜交結(jié)實(shí)率低下，這與王淑珍等[2]的試驗(yàn)結(jié)果一致。但種間雜交的不親和性使二組雜交組合的雜交結(jié)實(shí)率遠(yuǎn)低于常規(guī)栽培品種之間(8x×8x)的雜交結(jié)實(shí)率(一般均可達(dá)90%以上)。RG×紅玉雜交種子出苗率低于紅玉×RG，RG×紅玉雜交后代中4x以下的低倍性占了84.79%，而紅玉×RG雜交后代4x以下的低倍性占比46.67%，表明出苗率與雜交后代低倍性占比高低相關(guān)，這2個(gè)試驗(yàn)結(jié)果印證了低倍性野生種源與栽培種雜交時(shí)易產(chǎn)生雜交不結(jié)實(shí)、雜交種子成活率低等不親和現(xiàn)象。RG×紅玉雜交后代實(shí)生苗中3x植株占比為45.65%，2x、3x合計(jì)占比約達(dá)80.00%；而紅玉×RG雜交后代中未檢出2x植株，3x、4x、5x、6x植株的占比較接近，這可能與雜交后代性狀遺傳以母本為主導(dǎo)相關(guān)，雜交后代染色體倍性與母本存在較大的關(guān)聯(lián)性。2組種間雜交組合獲得了2x、3x、4x、5x、6x等多種倍性的種間雜交后代，這應(yīng)該與草莓中除正常減數(shù)配子外還存在未減數(shù)配子相關(guān)。時(shí)翠平等[4，10]研究發(fā)現(xiàn)，在草莓中存在未減數(shù)配子；細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果表明，草莓2n花粉的形成主要是由于減數(shù)分裂過程中，中期2個(gè)紡錘體的定向發(fā)生改變所致，由正常的十字形變?yōu)槠叫行魏桶俗中?，進(jìn)而形成了二分體和三分體，每個(gè)二分體產(chǎn)生2個(gè)2n花粉，每個(gè)三分體產(chǎn)生1個(gè)2n花粉和2個(gè)n花粉，此外還發(fā)現(xiàn)有極少量4n花粉。Bringhurst等[11]利用8x智利草莓和2x森林草莓雜交得到5x、6x、9x后代，認(rèn)為5x來自雙親正常減數(shù)配子，6x來自森林草莓的未減數(shù)配子，9x來自智利草莓的未減數(shù)配子。此外，草莓屬種間雜交發(fā)現(xiàn)偏母實(shí)生苗，研究認(rèn)為它們來源于假受精的無融合生殖[7]。

種間雜交后代變異大，在創(chuàng)造新種質(zhì)、新類型、新品種方面具有獨(dú)特之處。國內(nèi)外科學(xué)家已通過種間雜交得到了具有優(yōu)良特質(zhì)的多種倍性材料，加快了野生草莓資源的利用步伐[1，3-7，10-12]。本試驗(yàn)所獲種間雜交后代RH28在植株葉片細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)株型、TSS含量等方面介于父母本之間，但RH28已克服了母本RG匍匐莖抽生難這一缺點(diǎn)，可以通過抽生匍匐莖繁殖保存種源；同時(shí)RH28改善了母本RG花粉活力低、有活力花粉時(shí)期短的缺陷，在各個(gè)階段均有一定量的花粉活力，這為后續(xù)繼續(xù)用8x栽培種回交進(jìn)行漸滲系創(chuàng)制、選育新品種提供了基礎(chǔ)。

試驗(yàn)中我們關(guān)注到在大棚常規(guī)栽培條件下二倍體野生型黃毛草莓、東北草莓只開花，不能正常結(jié)果，僅有二倍體森林草莓RG能正常結(jié)果，但RG出現(xiàn)了花藥敗育現(xiàn)象，花藥僅在小蕾期有弱活性，這也是紅玉×RG雜交結(jié)實(shí)率低的主要原因。后續(xù)我們將從形態(tài)學(xué)、生理、蛋白質(zhì)組學(xué)等多方面進(jìn)行研究，探尋RG花藥敗育的機(jī)理。種間雜種鑒定方法包括了形態(tài)學(xué)觀察、染色體數(shù)目檢測、同功酶鑒定、原位雜交、分子生物學(xué)技術(shù)等。流式細(xì)胞術(shù)因其快速、簡便、所需樣品量少等優(yōu)點(diǎn)在染色體倍性快速鑒定中得到廣泛應(yīng)用，但倍性鑒定存在一定誤差?？▽毱芳t染色法染色體倍性鑒定準(zhǔn)確度高，但草莓屬植物染色體小，多倍體種染色體數(shù)目眾多，染色體觀察難度大、操作技術(shù)要求高。本試驗(yàn)種間雜種鑒定方法采用形態(tài)學(xué)和染色體數(shù)目檢測，根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定結(jié)果，結(jié)合田間觀察挑選部分種間雜交后代進(jìn)行卡寶品紅染色法倍性鑒定驗(yàn)證。后續(xù)我們將利用多種方法對(duì)種間雜種進(jìn)行鑒定，以期挖掘更多有價(jià)值的種間雜交后代。