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    百合多糖提取及其止咳作用研究

    2020-11-14 05:50:38孫國威周彥軍魏孔斌馬文芳
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2020年20期
    關(guān)鍵詞:氨水百合多糖

    孫國威,米 雪,周彥軍,魏孔斌,王 雅,馬文芳,李 軍

    (1.蘭州十百農(nóng)業(yè)生物科技有限公司,甘肅蘭州 730022;2.陜西科技大學,陜西西安 710021;3.蘭州大學第一醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000;4.蘭州市七里河區(qū)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化辦,甘肅 蘭州 730050;5.蘭州理工大學,甘肅 蘭州 730050)

    0 引言

    百合是百合科百合屬植物,百合植物的鱗莖既可食用、也可藥用,是我國首批的藥食兩用植物之一[1]。百合營養(yǎng)豐富,其鱗莖主要含有多糖、皂苷、生物堿、黃酮、多酚等生物活性物質(zhì),另外還含有一些蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素、必需氨基酸和必需微量元素等基本營養(yǎng)物質(zhì)[2]。因此,既可利用其藥用價值,也可以發(fā)揮其營養(yǎng)保健功能。

    百合多糖是其主要功能性成分之一,藥理研究證明,其具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、抑菌等[3-6]生理功能。以蘭州百合鱗莖為原料,采用酶解輔助法從百合中提取粗多糖,并進行百合粗多糖止咳作用研究,最大限度地提高百合利用率,提高百合附加值,為百合的進一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    百合干片,甘肅省輕工科學研究所提供;復合酶,和氏璧生物技術(shù)有限公司提供。

    無水葡萄糖、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、無水亞硫酸氫鈉、氨水等,均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DHG-9030 型電熱鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品;AL204 型電子分析天平,上海梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品;HH-4 型電熱恒溫水浴鍋,北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品;RE52CS-1 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;FDU-1200 型冷凍干燥機,上海愛郎儀器有限公司產(chǎn)品。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 原料預(yù)處理

    將百合干片粉碎,裝袋備用。

    1.3.2 百合多糖提取

    5 g 百合干片→粉碎→脫脂→干燥→稱質(zhì)量→復合酶法提取→滅酶→抽濾→蒸發(fā)濃縮→醇沉→冷凍干燥→稱質(zhì)量→密封保藏。

    1.3.3 單因素試驗設(shè)計

    酶添加量的選擇:固定料液比1∶15(g∶mL),提取時間30 min,提取溫度50 ℃,分別考查酶添加量在3.0%,3.5%,4.0%,4.5%,5.0%的條件下對百合粗多糖得率的影響;料液比的選擇:固定酶添加量4%,提取時間30 min,提取溫度50 ℃,分別考查料液比在1∶15,1∶20,1∶25,1∶30,1∶35(g∶mL) 的條件下對百合粗多糖得率的影響;提取時間的選擇:固定酶添加量4%,料液比1∶15(g∶mL),提取時間30 min,分別考查提取溫度在30,40,50,60,70 ℃的條件下對百合粗多糖得率的影響;提取溫度的選擇:固定酶添加量4%,料液比1∶15(g∶mL),提取溫度50 ℃,分別考查提取時間10,20,30,40,50 min 的條件下對百合粗多糖得率的影響。每組試驗重復3 次。

    1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,固定酶添加量為4%,選擇提取溫度、提取時間和料液比3 個因素,采用Design Expert 8.0.6 軟件進行三因素三水平的Boxbehnken 中心組合試驗設(shè)計。

    Box-behnken 試驗設(shè)計因素與水平設(shè)計見表1。

    表1 Box-behnken 試驗設(shè)計因素與水平設(shè)計

    1.3.5 百合多糖止咳作用研究

    (1) 百合多糖對SO2引咳小鼠的止咳作用。24 只小鼠雌雄各半,隨機分成4 組:空白組、陽性對照組(可待因30 mg/kg/d)、百合粗多糖高、低劑量組(40,20 mg/kg/d),各組均灌胃給藥,每日1 次,連續(xù)7 d,其中空白組給予等體積生理鹽水。于末次給藥1 h 后,用50%濃硫酸5 mL,滴加至盛有0.5 g 無水亞硫酸氫鈉的平板上,立即將1 L 的玻璃燒杯倒扣在平皿上,燒杯內(nèi)隨即產(chǎn)生SO2氣體。然后迅速將各組小鼠分別放入燒杯內(nèi),觀察并記錄小鼠的咳嗽潛伏期(小鼠放入至出現(xiàn)咳嗽的時間),以及開始咳嗽后3 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù),其中以小鼠出現(xiàn)明顯的張口喘息為咳嗽指標。

    (2) 百合多糖對氨水引咳小鼠的止咳作用。24 只小鼠雌雄各半,隨機分成4 組:空白組、陽性對照組(可待因30 mg/kg/d)、百合粗多糖高、低劑量組(40,20 mg/kg/d),各組均灌胃給藥,每日1 次,連續(xù)7 d,其中空白組給予等體積生理鹽水。于末次給藥1 h 后,將小鼠分別置于1 L 倒置的玻璃燒杯中,通過霧化器從燒杯底部小口處通入25%的氨水15 s,觀察并記錄小鼠的咳嗽潛伏期(小鼠放入至出現(xiàn)咳嗽的時間),以及開始咳嗽后3 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù),其中以小鼠出現(xiàn)明顯的張口喘息為咳嗽指標。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

    2.1.1 酶添加量對百合多糖得率的影響

    酶添加量對百合多糖得率的影響見圖1。

    隨著酶添加量的增加,復合酶與底物的接觸面積增加,致使多糖能夠更快地分離出來,當酶添加量大于4%時,得率上升趨勢逐漸趨于平緩,說明酶添加量達到4%時,酶與底物的反應(yīng)逐漸趨于飽和,再增加酶的添加量,得率變化反而不大。因此,酶的最適添加量為4%。

    2.1.2 提取溫度對百合多糖得率的影響

    提取溫度對百合多糖得率的影響見圖2。

    酶都需要在最適溫度條件下才能表現(xiàn)出較高的活性,由圖2 可知,百合多糖得率隨著溫度的增長不斷升高,在50 ℃時得率達到最大21.2%,說明此時可能是復合酶的最適溫度,但之后隨著溫度的升高,復合酶活力逐漸降低,直至失活,百合多糖得率也逐漸降低。因此,最適酶解溫度為50 ℃。

    2.1.3 提取時間對百合多糖得率的影響

    提取時間對百合多糖得率的影響見圖3。

    由圖3 可知,百合多糖得率隨酶解時間的延長而增加,當酶解時間超過30 min 時,百合多糖得率開始下降。酶解時間太短,反應(yīng)不充分,多糖不能充分溶出,而當酶濃度達到一定值時,隨著酶促時間延長,并不能增加多糖的得率,反而會使得率下降。因此,最佳提取時間為30 min。

    2.1.4 料液比對百合多糖得率的影響

    料液比對百合多糖得率的影響見圖4。

    由圖4 可知,料液比在1∶15~1∶35 時,隨著料液比的增加,百合多糖得率逐漸增大,但當料液比達到1∶25(g∶mL) 時,多糖得率開始呈下降趨勢,可能是由于料液比增大,酶與底物的接觸減小,酶解效果變差造成的。因此,最佳料液比為1∶25(g∶mL)。

    2.2 百合多糖提取工藝的優(yōu)化

    2.2.1 Box-behnken 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果

    選取料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C) 進行三因素三水平共17 組Box-behnken 響應(yīng)面分析試驗。

    Box-behnken 中心組合設(shè)計試驗及結(jié)果見表2。

    表2 Box-behnken 中心組合設(shè)計試驗及結(jié)果

    2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析

    利用Design Expert 8.0.6 軟件對百合多糖提取試驗結(jié)果進行多元回歸擬合,得到以百合多糖得率為目標函數(shù)的二次回歸方程為:

    響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析見表3。

    表3 響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析

    由表3 可知,模型的p<0.001,表示回歸方程差異極顯著,失擬項p 值為0.347 7,不顯著,說明該模型能夠很好的擬合試驗數(shù)據(jù)?;貧w方程決定系數(shù)R2=0.964 9,調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.919 8,表明回歸方程具有較好的擬合度。料液比的一次項達到了顯著水平,提取溫度的一次項達到了高度顯著。影響因素由大到小順序為提取溫度>料液比>提取時間。此外,料液比和提取時間的交互作用,提取時間和提取溫度的交互作用也達到了顯著水平。料液比、提取時間和提取溫度的二次項均達到了高度顯著。

    2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

    響應(yīng)面曲面圖和等高線圖由Design Expert 8.0.6軟件繪制。

    各因素交互作用對百合多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線圖見圖6。

    經(jīng)Design Expert 軟件優(yōu)化,響應(yīng)面優(yōu)化模型預(yù)測百合多糖最佳提取工藝條件為料液比1∶25.57(g∶mL),提取時間30.92 min,提取溫度53.79 ℃。理論計算百合多糖的最佳得率為24.04%,考慮到實際操作的可行性和方便性,將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為料液比1∶26(g∶mL),提取時間31 min,提取溫度54 ℃,并在該條件下進行平行3 次驗證試驗,實際測得的得率為23.80%,預(yù)測值誤差為1.0%。

    2.3 百合粗多糖對SO2 致咳小鼠的止咳作用評價

    百合粗多糖對SO2引咳小鼠的影響(X±SD) 見表4。

    表4 百合粗多糖對SO2 引咳小鼠的影響(X±SD)

    由表4 可知,與空白對照組相比,高劑量百合粗多糖可顯著延長SO2致咳小鼠的咳嗽潛伏期(p<0.05)、明顯減少咳嗽次數(shù),咳嗽抑制率為25.8%,止咳活性為46.5%。表明百合粗多糖具有一定的止咳作用。

    2.4 百合粗多糖對氨水致咳小鼠的止咳作用評價

    百合粗多糖對氨水引咳小鼠的影響(X±SD) 見見表5。

    表5 百合粗多糖對氨水引咳小鼠的影響(X±SD)

    由表5 可知,與空白對照組相比,高劑量百合粗多糖可顯著延長氨水致咳小鼠的咳嗽潛伏期(p<0.05)、減少咳嗽次數(shù)(p<0.05),咳嗽抑制率為37.8%,止咳活性為67.2%。表明百合粗多糖具有一定的止咳作用。

    3 結(jié)論

    響應(yīng)面法優(yōu)化出百合多糖提取的最佳工藝條件為料液比1∶26(g∶mL),提取時間31 min,提取溫度54 ℃。進行3 次驗證試驗,實際測得得率為23.80%,與理論計算的百合多糖最大得率進行比較,誤差僅為1%,說明該模型具有實際應(yīng)用價值。百合粗多糖對小鼠止咳試驗結(jié)果:與空白對照組相比,百合粗多糖高劑量組能夠延長小鼠咳嗽潛伏期,縮短3 min 內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù),作用效果略低于陽性對照組。說明百合粗多糖可以改善咳嗽癥狀,具有止咳作用。

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