重金屬對不同地區(qū)鱸魚酶活及性激素的相關(guān)性分析

劉 源

（河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 471023）

重金屬污染是指重金屬及其化合物對大氣、水、土壤等造成的環(huán)境污染。重金屬污染對海洋生物的生長與繁殖的影響日趨嚴(yán)重[1]，海洋中的重金屬吸附于懸浮顆粒，隨沉淀物沉沒于水底。因此，重金屬污染極難被生物降解[2-5]，且重金屬經(jīng)過生物的富集的作用，通過食物鏈進(jìn)入人體，并對人體造成一系列的健康問題。隨著我國居民生活水平的提高，海洋魚類也成為了餐桌上必不可少的食物，而鱸魚又因其營養(yǎng)價值高、味道鮮美、肉質(zhì)細(xì)嫩成為廣大食客的首選魚類。

金屬硫蛋白（MT） 是能與多種重金屬結(jié)合的一類低分子蛋白[6]，并會對機(jī)體內(nèi)的重金屬含量具有調(diào)節(jié)作用，從而達(dá)到維持其在機(jī)體內(nèi)的平衡目的[7-8]。GST 酶和EROD 酶是有機(jī)污染物及其化合物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化過程中重要的酶，可以通過酶的活性來預(yù)測其在生物體內(nèi)的污染情況[9]。近海沉淀物中的有機(jī)污染物會使EROD 酶的活性升高[10]。在某些重金屬離子的脅迫作用下，可促進(jìn)EROD 酶的活力，因此其可作為一個監(jiān)測水體重金屬污染的指標(biāo)。國內(nèi)外的大多數(shù)研究集中于有機(jī)污染物的影響研究，重金屬與多環(huán)芳烴在不同營養(yǎng)級的富集是一個動態(tài)復(fù)雜的過程，多環(huán)芳烴會引起EROD 酶活性的上升，重金屬對魚類體內(nèi)EROD 微粒體同樣具有體內(nèi)和體外的誘導(dǎo)作用[11]。國內(nèi)外在重金屬對魚類生殖方面研究比較單一，多種金屬元素與性激素的相關(guān)性研究鮮有報道，且雌二醇和睪酮的含量對魚類性腺的發(fā)育、成熟起著重要的作用。羅永巨[12]研究發(fā)現(xiàn)重金屬鎘會使雌二醇的含量升高，在鎘的脅迫作用下，羅非魚的孵化率降低，畸形率升高。

試驗(yàn)研究了5 個不同地區(qū)鱸魚體內(nèi)14 種重金屬的含量與MT、酶活性及性激素含量的相關(guān)性，探究了14 種重金屬元素在魚體內(nèi)的富集情況與MT、酶活性及性激素含量的關(guān)系，為該地區(qū)重金屬在海洋生態(tài)及海洋魚類的污染情況提供理論數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與主要儀器

材料：于A，B，C，D，E 等5 個地區(qū)隨機(jī)捕撈鱸魚各22 條。

試劑：5,5' -二硫硝基苯甲酸（DTNB），西安赫特生物科技有限公司提供；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA），美國Sigma 公司提供；三羥甲基氨基甲烷（Tries-HCl），天津百倫斯生物技術(shù)有限公司提供；GST 酶試劑盒、EROD 酶試劑盒，上海江萊生物科技有限公司提供；E2 和T 試劑盒，上海橋杜生物科技有限公司提供。

儀器：PinAAcle 900H 型原子吸收光譜儀，美國Perkin Elmer 公司產(chǎn)品；Multiwave PRO 型微波消解儀，奧地利Anton Paar 公司產(chǎn)品；H2500R 型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；FA1004B 型電子天平，上海精密儀表有限公司產(chǎn)品；680 型全自動酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品，UV2600 型紫外可見分光光度計，日本Shimadzu 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將各地區(qū)捕撈的鱸魚置于魚缸中，為確保其活力，進(jìn)行沖氧并分別進(jìn)行編號1～22，然后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室對其解剖并進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.2.2 不同地區(qū)魚體內(nèi)重金屬元素含量測定

稱取魚樣約0.2 g 置于25 mL 的消解罐中，加入8 mL HNO3和4 mL H2O2，室溫條件下消解過夜，然后在120 ℃條件下消解3 h，將消解液置于50 mL 的容量瓶中進(jìn)行定容。取消解液50 μL，進(jìn)行重金屬的測定。該原子吸收光譜為火焰-石墨爐一體機(jī)。

1.2.3 不同地區(qū)鱸魚體內(nèi)金屬硫蛋白（MT） 的測定

參照嚴(yán)國等人[13]的方法稍作修改。稱取新鮮魚樣10.000 g，剁碎，顆粒盡量細(xì)小，然后在高速均質(zhì)機(jī)內(nèi)均質(zhì)3 次，每次1 min，取1.000 g 加入0.1 mol/L的Tris-HCl 緩沖液6 mL，在4 ℃環(huán)境下?lián)u勻，抽提8 h；將該液體置于4 ℃下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心5 min，收集上清液；于90 ℃水浴下加熱3 min，降至室溫，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心5 min，收集上清液；加入3 mL 的無水乙醇，于-18 ℃下沉淀12 h；再以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心5 min；取沉淀加入0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液5 mL 溶解2 h；以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心5 min，收集上清液用于測定MT 含量。

1.2.4 不同地區(qū)鱸魚體內(nèi)酶活性的測定

按1.2.3 處理魚樣，取5.000 g 加入PBS 緩沖液勻漿機(jī)內(nèi)勻漿，在高速冷凍離心機(jī)里以轉(zhuǎn)速20 000 r/min離心10 min 后取上清液，對GST 酶和EROD 酶活性的測定按試劑盒的步驟進(jìn)行測定。

1.2.5 不同地區(qū)鱸魚血清內(nèi)性激素含量測定

將稱好質(zhì)量的魚肉組織，加入質(zhì)量10 倍體積的PBS 緩沖溶液溶液。隨后進(jìn)行組織勻漿。組織勻漿好后，在4 ℃下以轉(zhuǎn)速20 000 r/min 離心5 min。隨后收集勻漿液的上清液。性激素的含量按上海橋杜生物科技有限公司提供的說明書進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 A 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析

金屬硫蛋白易與重金屬結(jié)合，在調(diào)節(jié)魚體內(nèi)重金屬的平衡起著重要的作用，不同地區(qū)的重金屬含量存在差異，機(jī)體的調(diào)節(jié)能力也存在個體差異。Se元素是人體必需的微量元素之一，在酸性條件下，金屬硫蛋白的金屬易解離出來；在中性介質(zhì)下，該解離的蛋白又會與Se 結(jié)合形成類金屬硫蛋白[14]。從表1 可以看出，A 地區(qū)Se 的含量與MT 呈正相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.51；對該地區(qū)而言，可以根據(jù)金屬硫蛋白的含量大致反映出Se 在魚體內(nèi)的富集狀況。性激素的含量能夠體現(xiàn)魚體的孵化、生長及繁殖情況，As 的含量與E2 呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），相關(guān)系數(shù)為-0.59，可見As 的含量越高，魚體所分泌的雌二醇越低；Zn 的含量與T 睪酮呈負(fù)相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.42，重金屬Zn 的含量高，則會引起睪酮的分泌量減少。A 地區(qū)重金屬含量與GST 酶及EROD 酶的活性不具有相關(guān)性。

A 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析見表1。

2.2 B 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析

海水中的重金屬大多以與懸浮的顆粒相結(jié)合的形式存在，另一方面是工業(yè)生產(chǎn)及人類生活產(chǎn)生的污染（該污染物大多是與有機(jī)物結(jié)合，形成難以分解的有機(jī)物污染物）。

表1 A 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析

B 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析見表2。

由表2 可知，B 地區(qū)Se 的含量與MT 呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.46，可見金屬硫蛋白在該地區(qū)與Se 的結(jié)合能力要強(qiáng)于另外13 種元素；As 的含量與EROD 酶呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05） 相關(guān)系數(shù)為-0.45。EROD 酶是重金屬在魚體內(nèi)轉(zhuǎn)化的重要酶，EROD 酶的活性越高，重金屬As 的含量越低?？梢?，魚體為了維持體內(nèi)As 的平衡，EROD 酶通過將體內(nèi)含重金屬As 的污染物分解，從而排出機(jī)體外。對于B 地區(qū)而言，重金屬含量與雌二醇和睪酮不存在相關(guān)性。因此，為了了解該地區(qū)鱸魚生長狀況，可對試驗(yàn)之外的重金屬進(jìn)行測定，從而確定是否存在某一重金屬與雌二醇及睪酮存在相關(guān)性。

表2 B 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析

2.3 C 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析

C 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析見表3。

由表3 可知，C 地區(qū)As 的含量與MT 呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.44，該地區(qū)在魚體內(nèi)As 元素結(jié)合金屬硫蛋白的能力最強(qiáng)；Sn 的含量與EROD 酶呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），相關(guān)系數(shù)為-0.53，EROD 酶的活性越高，重金屬Sn 的含量越低，因此該區(qū)域的鱸魚對重金屬Sn 在其體內(nèi)的平衡具有一定的調(diào)節(jié)作用；Sn 的含量與T 睪酮呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.42，魚體內(nèi)Sn 的含量較高時，睪酮的分泌量減少，從而對鱸魚在該區(qū)域的生長產(chǎn)生不利的影響；Ba 的含量與T 睪酮呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.47，魚體內(nèi)Ba 的含量在較高的水平下，鱸魚睪酮的分泌量較多。由于某些重金屬之間存在的競爭機(jī)制，因而機(jī)體的生長狀況要綜合多方面的因素進(jìn)行考量。重金屬含量與GST 酶不具有相關(guān)性。

表3 C 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析

2.4 D 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析

D 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析見表4。

由表4 可知，D 地區(qū)重金屬Ni、Ag 和Cr 的含量與MT 呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.55，0.63，0.55；重金屬V、Cu 和Ba 的含量與MT 呈顯著正相關(guān)（p＜0.05） 相關(guān)系數(shù)分別為0.51，0.44，0.51，該水域內(nèi)鱸魚體內(nèi)重金屬Ni、Ag 和Cr與金屬硫蛋白的結(jié)合能力較強(qiáng)，重金屬元素V、Cu和Ba 與金屬硫蛋白的結(jié)合能力要弱于前3 種，重金屬元素與金屬硫蛋白結(jié)合能力為Ag＞Ni=Cr＞V=Ba＞Cu，其中重金屬元素Ag 結(jié)合金屬硫蛋白的能力最強(qiáng)，重金屬元素Cu 的結(jié)合能力最弱；Sn 的含量與MT 顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.40；可見重金屬Sn 的含量較高時，金屬硫蛋白的含量較低。重金屬Cu 的含量與EROD 酶呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.43，可見重金屬元素Cu 含量在一定范圍內(nèi)含量越高，EROD 酶活性越高，即在Cu2+的脅迫下，Cu2+具有誘導(dǎo)EROD 活力的能力，且起著促進(jìn)作用，這與劉志[15]的研究結(jié)論相似。重金屬Co、V和Ba 的含量與E2 呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為-0.44，-0.42，-0.51；Cd 的含量與E2 呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01） 相關(guān)系數(shù)為-0.67，重金屬元素對雌二醇的影響能力大小為Cd＞Ba＞Co＞V，Cd、Co、V 和Ba 的含量越高，雌二醇的含量越低，Cd 元素的影響最大；As 的含量與T 睪酮呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.41，重金屬元素的含量與GST 酶活力不存在相關(guān)性。

表4 D 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析

2.5 E 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析

E 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析見表5。

由表5 可知，E 地區(qū)重金屬Ni、V、Cr、Mn、Ba 的含量，As 含量與MT 呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.47，0.49，0.47，0.47，0.46，0.42，該水域內(nèi)重金屬元素與金屬硫蛋白的結(jié)合能力依次為V＞Ni=Cr=Mn＞Ba＞As，其中重金屬元素V 與金屬硫蛋白的結(jié)合能力最強(qiáng)，As 的結(jié)合能力最弱；重金屬Pb 的含量與GST 呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.45，重金屬元素Pb 的含量在一定范圍內(nèi)，在Pb2+的脅迫作用下，其能夠促進(jìn)GST 酶的活力提升，還有研究人員研究發(fā)現(xiàn)在Pb2+脅迫作用下河蜆GST 酶活力顯著的高于對照組（p＜0.05），這與該研究結(jié)論相一致?？梢愿鶕?jù)鱸魚體內(nèi)GST 酶活力作為來監(jiān)測水體中重金屬Pb2+的污染情況，該水域的重金屬元素與雌二醇及睪酮的含量不存在相關(guān)性。

表5 E 地區(qū)鱸魚體內(nèi)重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

（1） 5 個地區(qū)重金屬元素與金屬硫蛋白都具有相關(guān)性，且呈正顯著相關(guān)（p＜0.05），不同水域與金屬硫蛋白相結(jié)合的重金屬元素不同，其結(jié)合能力的大小不同。

（2） B 和E 水域內(nèi)這14 種重金屬元素與鱸魚的雌二醇及睪酮的含量不具有相關(guān)性。

（3） 重金屬離子在一定的含量范圍內(nèi)，在某種金屬離子（如Cu2+、Pb2+） 的脅迫作用下，會促進(jìn)GST 酶或EROD 酶的活力，從而調(diào)節(jié)該金屬元素在鱸魚體內(nèi)的含量，使細(xì)胞避免損傷。

（4） 可以根據(jù)鱸魚體內(nèi)的GST 酶或EROD 酶的活力可以作為指標(biāo)來監(jiān)測某些重金屬元素在水體內(nèi)的污染狀況，機(jī)體對重金屬元素具有調(diào)節(jié)能力且這種調(diào)節(jié)能力是有限的，金屬硫蛋白在其中起著至關(guān)重要的作用。