M2型丙酮酸激酶對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞功能的影響

楊怡圓 周仁鵬 候家琳 王麒瑞 梁奕敏 王丹茹

瘢痕疙瘩是以細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)過度沉積于真皮，以及成纖維細(xì)胞過度增殖為特征的過度纖維化疾病[1-3]，具體的病因?qū)W和形成機(jī)制尚未明確。目前，臨床上采用手術(shù)切除后進(jìn)行放療的方法進(jìn)行治療[4-5]。根據(jù)瘢痕疙瘩形成機(jī)制，針對有效靶點(diǎn)設(shè)計藥物進(jìn)行治療是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

瘢痕疙瘩與腫瘤有一定的相似性[6-7]，在生物能量代謝方面，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞也表現(xiàn)出與腫瘤細(xì)胞相似的代謝特征：以糖酵解方式為主進(jìn)行糖代謝。這種代謝方式使得瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞無論在常氧或缺氧環(huán)境下都能保證其增殖和存活[8]。M2型丙酮酸激酶(Pyruvate kinase M2，PKM2)是糖代謝中的關(guān)鍵酶之一，是調(diào)控有氧糖酵解的關(guān)鍵因子，并具有蛋白激酶活性和調(diào)控基因表達(dá)等其他功能[9-12]。但PKM2在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)和作用尚未得到關(guān)注。本研究旨在初步評估PKM2對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗試劑及儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)；胎牛血清、0.25%EDTA-胰蛋白酶(Gibco公司，美國)；Ⅰ型膠原酶(SERVA公司，德國)；Trizol(Invitrogen公司，美國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)；Ki67抗體(邁新公司)；PKM2抗體(CST公司，美國)；β-actin抗體(Affinity公司，美國)；羊抗鼠/兔二抗(Jackson公司，美國)；酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；Collagen Ⅰ抗體、Collagen Ⅲ抗體(Abcam公司，美國)；CCK - 8 細(xì)胞增殖檢測試劑盒(同仁化學(xué)，日本)；EdU-555熒光細(xì)胞增殖檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PKM2-IN-1(MCE公司，美國)；Seahorse XF分析儀(安捷倫公司，美國)；Citation 5成像儀(BioTek公司，美國)；StepOnePlus PCR儀(Life Technologies公司，美國)。

1.2 瘢痕疙瘩與正常皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

經(jīng)患者知情同意后，收集我科手術(shù)獲取的未經(jīng)任何藥物或激素治療的瘢痕疙瘩組織及手術(shù)切除部位周圍無瘢痕存在的正常皮膚組織，將這些組織取部分全層皮膚進(jìn)行石蠟包埋，制備成石蠟塊保存?zhèn)溆?。余下組織在修剪表皮及多余皮下組織后用眼科剪剪成肉糜樣，加入0.3%膠原酶溶液，37 ℃消化4～6 h；經(jīng)兩次離心、棄上清、培養(yǎng)基重懸后，將細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，放入37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。24 h后換液，鏡下觀察細(xì)胞生長情況。當(dāng)細(xì)胞生長面積達(dá)培養(yǎng)皿80%～90%時，加入適量的0.25%EDTA-胰蛋白酶，37 ℃消化3 min。細(xì)胞變圓、部分細(xì)胞漂起時，加入2～3 mL完全培養(yǎng)基終止消化。1 000 r/min離心3 min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基，此為第一代瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞或正常皮膚成纖維細(xì)胞，記為P1。后續(xù)實(shí)驗取P1～4成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

1.3 免疫組化染色檢測組織中PKM2及增殖相關(guān)標(biāo)志物(Ki67)的表達(dá)

以3～4 μm厚度制備瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，檸檬酸鈉高溫高壓修復(fù)抗原2 min；4%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶；孵育一抗(PKM2、Ki67)和二抗(酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG)；顯色、復(fù)染、返藍(lán)；無水乙醇脫水，晾干后用中性樹膠封片。根據(jù)文獻(xiàn)[13-14]的方法，采用免疫組化染色快速評分(Q)法：每張切片至少評價5個高倍鏡視野，評估其陽性細(xì)胞與染色強(qiáng)度；陽性細(xì)胞評分(P)按照陽性細(xì)胞數(shù)(N)占同類細(xì)胞數(shù)(M)的百分比評估，P=N/M×100%；染色強(qiáng)度評分(I)按照切片中細(xì)胞著色深淺評分，0分為細(xì)胞不著色，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)Q=P×I計算免疫組化染色快速評分。

1.4 Real-time PCR檢測成纖維細(xì)胞中PKM2及纖維化指標(biāo)的表達(dá)

以每皿4×105個細(xì)胞將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞分別接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至90%后，用Trizol充分裂解細(xì)胞，按說明書提取細(xì)胞RNA，Nano Drop分光光度計測RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，步驟參照試劑盒使用說明書。引物均由上海生工公司合成：β-actin(F 5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3′、R 5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′；PKM1(F 5′- TTGTGCGAGCCTCAAGTCACT -3′、R 5′- CTGACGAGCTGTCTGGGGAT -3′；PKM2(F 5′-CGCATGCAGCACCTGATTG -3′、R 5′- CCACTGCAGCACTTGAAGGA -3′)；COL1A1(F 5′- AGTGGTTTGGATGGTGCCAA -3′、R 5′- GCACCATCATTTCCACGAGC -3′)；COL1A2(F 5′- TGGTCTCGGTGGGAACTTTG -3′、R 5′- CACCCTGTGGTCCAACAACT -3′)；COL3A1(F 5′-CTTCTCTCCAGCCGAGCTTC -3′、R 5′- TAGTCTCACAGCCTTGCGTG -3′)。使用StepOnePlus PCR儀及Real-time PCR試劑盒進(jìn)行熒光定時定量PCR擴(kuò)增，以管家基因 β-actin的mRNA水平作為對照，通過2-△△Ct法來進(jìn)行相對定量。

1.5 Western-blot檢測成纖維細(xì)胞中PKM2的表達(dá)

按每皿9×105個細(xì)胞將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞分別接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至90%后，用全細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞提取總蛋白，以每個樣品30 μg蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE。轉(zhuǎn)膜：按照陽極-海綿-濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙-海綿-陰極固定后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)；封閉：5%脫脂牛奶PBST溶液室溫封閉PVDF膜；加入相應(yīng)一抗(PKM2、β-actin)，4 ℃孵育過夜；洗膜后加入相應(yīng)二抗(羊抗鼠/兔二抗)，37 ℃孵育2 h。將顯影液均勻加到PVDF膜上，等待1 min后，暗室曝光。

1.6 Seahorse XF技術(shù)檢測糖酵解功能

提前24 h將兩種成纖維細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為2.5×104個，每組至少6個復(fù)孔；水化探針：在水化96孔板里加入細(xì)胞培養(yǎng)級的水200 μL，將探針板放在水化孔板上，置于37 ℃無CO2培養(yǎng)箱過夜后吸出。清洗細(xì)胞，保留每孔20 μL原始培養(yǎng)基，緩慢貼壁加入200 μL分析培養(yǎng)基，探針板每孔加入200 μL的XF校準(zhǔn)液，置入37 ℃無CO2培養(yǎng)箱45～60 min備用。檢測用試劑按產(chǎn)品說明書配置，按順序在孔道A、B、C中依次加入glucose、oligomycin、2-DG相應(yīng)試劑，使用Seahorse XF分析儀檢測，探針板與水化孔板組裝、校準(zhǔn)后，將水化孔板替換成細(xì)胞培養(yǎng)板開始檢測。

1.7 PKM2抑制劑處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后檢測其增殖、糖酵解功能及膠原合成

1.7.1 PKM2抑制劑處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞

PKM2抑制劑(PKM2-IN-1)購自MCE公司(美國)，按照說明書用細(xì)胞培養(yǎng)級的DMSO溶解藥物配制成10 mmol/L儲存液。使用時用DMSO稀釋儲存液至不同藥物濃度后，加入完全培養(yǎng)基，配制成含所需藥物濃度的培養(yǎng)液后用于后續(xù)實(shí)驗。

1.7.2 EdU-555熒光標(biāo)記檢測細(xì)胞增殖

按每孔約2×104個細(xì)胞將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種于24孔板中，預(yù)培養(yǎng)過夜。更換含不同濃度(0、0.5、2 μmol/L)PKM2抑制劑的完全培養(yǎng)基處理后，吸去1/2體積培養(yǎng)液，按EdU檢測試劑盒說明書配置2倍的EdU工作液并預(yù)熱，與剩余培養(yǎng)基等體積加入24孔板中，使24孔板中的EdU終濃度為10 μmol/L；繼續(xù)孵育細(xì)胞3 h進(jìn)行EdU標(biāo)記；4%多聚甲醛室溫固定15 min后洗滌細(xì)胞，每孔用500 μL的含0.3%Triton X-100的PBS(通透液)進(jìn)行通透，室溫10～15 min；洗滌細(xì)胞1～2次。EdU染色：按說明書配制Click反應(yīng)液，每孔加入300 μL的Click反應(yīng)液，均勻覆蓋孔底，室溫避光30 min；細(xì)胞核染色：按說明書配制 Hoechst染色液，洗滌后每孔加300 μL，室溫避光孵育10 min；洗滌后使用Citation 5成像儀檢測。

1.7.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況

按每孔約2 000個細(xì)胞將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種至96孔板，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后更換為含PKM2抑制劑(濃度2 μmol/L)的完全培養(yǎng)基，每組至少3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng) 24、48、72 h。PBS清洗細(xì)胞后，每孔加入90 μL的DMEM完全培養(yǎng)基與10 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的光密度值。

1.7.4 Seahorse XF技術(shù)檢測細(xì)胞糖酵解功能

提前24 h將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為2.5×104個，待細(xì)胞貼壁生長后，更換含不同濃度(0、0.5、1、2 μmol/L)PKM2抑制劑的完全培養(yǎng)基；后續(xù)步驟同1.6。

1.7.5 Western-blot檢測細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)

按每皿4×105個細(xì)胞將兩種成纖維細(xì)胞分別接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁生長后，用含不同濃度(0、0.5、1、2 μmol/L)PKM2抑制劑的完全培養(yǎng)基處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞24 h。待細(xì)胞長滿至90%后，收集細(xì)胞，以全細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，后續(xù)步驟同1.5，其中一抗為Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、β-actin，二抗為羊抗鼠/兔二抗。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩種組織及其相應(yīng)的成纖維細(xì)胞中PKM2的表達(dá)

如圖1所示，PKM2在正常皮膚組織中陽性強(qiáng)度更弱、陽性范圍更少；在瘢痕疙瘩組織中，陽性產(chǎn)物呈棕黃色，主要定位在成纖維細(xì)胞內(nèi)。免疫組化快速評分結(jié)果表明，PKM2在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)較正常皮膚組織明顯升高(P<0.001)。

A：免疫組化染色(藍(lán)色箭頭：染色陰性；紅色箭頭，染色陽性)；B：免疫組化快速評分(***： P<0.001)A: Immunohistochemical staining (Blue arrow: negative staining; Red arrow: positive staining); B: Statistical results of immunohistochemistry score(***： P<0.001)圖1 免疫組化染色檢測PKM2在瘢痕疙瘩組織及正常皮膚組織中的表達(dá)Fig. 1 Expression of PKM2 in keloid tissue and normal skin tissue detected by immunohistochemistry

如圖2所示，mRNA水平檢測結(jié)果表明，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的PKM2表達(dá)水平顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，由同一基因編碼的不同轉(zhuǎn)錄本PKM1的表達(dá)兩種細(xì)胞無顯著差異(P>0.05)；Western-blot結(jié)果提示瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的PKM2蛋白表達(dá)顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞(P<0.05)。

A：Western-blot檢測PKM2蛋白表達(dá)；B：灰度值分析；C：Real-Time PCR檢測PKM2的mRNA水平(*： P<0.05； **： P<0.01)A: Expression of PKM2 by Western blot; B: Grayscale analysis; C: Expression of PKM2 mRNA by Real-time PCR (*: P<0.05; **： P<0.01)圖2 正常皮膚成纖維細(xì)胞和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞PKM2表達(dá)Fig. 2 Expression of PKM2 in KFs and NFs

2.2 兩種組織中增殖相關(guān)標(biāo)志物檢測及其相應(yīng)成纖維細(xì)胞中纖維化指標(biāo)檢測

Ki67是常用的增殖相關(guān)標(biāo)志物。圖3表明，Ki67蛋白免疫組化陽性染色定位于細(xì)胞核，陽性產(chǎn)物呈棕黃色；Q值統(tǒng)計顯示瘢痕疙瘩真皮層中Ki67表達(dá)明顯高于正常皮膚組織(P<0.01)。

瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中COL1A1與COL1A2的mRNA表達(dá)水平明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，兩者差異具有顯著性(P<0.001)，而COL3A1的mRNA表達(dá)未見明顯差異(P>0.05)；相比正常皮膚成纖維細(xì)胞，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原mRNA的比例發(fā)生改變(圖4)。

A：免疫組化染色(藍(lán)色箭頭：染色陰性；紅色箭頭，染色陽性)；B：免疫組化快速評分A: Immunohistochemical staining (Blue arrow: negative staining; Red arrow: positive staining); B: Statistical results of immunohistochemistry score圖3 免疫組化檢測Ki67在瘢痕疙瘩組織及正常皮膚組織中的表達(dá)(**： P<0.01)Fig. 3 Expression of Ki67 in keloid tissue and normal skin tissue detected by immunohistochemistry (**： P<0.01)

A：COL1A1、COL1A2及COL3A1的mRNA表達(dá)；B：Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原mRNA比例(***： P<0.001)A: The relative mRNA expression of COL1A1,COL1A2 and COL3A1; B: Expression ratio of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ (***： P<0.001)圖4 Real-time PCR 檢測正常皮膚成纖維細(xì)胞和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中COL1A1、COL1A2及COL3A1的mRNA表達(dá)Fig. 4 The relative mRNA expression of COL1A1, COL1A2 and COL3A1 detected by Real-time PCR

2.3 正常皮膚成纖維細(xì)胞及瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞糖酵解水平檢測

實(shí)驗以細(xì)胞外基質(zhì)酸化率(Extra-cellular acidification rate，ECAR)為指標(biāo)進(jìn)行記錄。加入葡萄糖前的ECAR水平為非糖酵解酸化，加入葡萄糖后增加的ECAR水平為糖酵解水平，加入寡霉素后繼續(xù)增加的ECAR值代表糖酵解儲備，在加入2-DG之前所測得的最大ECAR值與非糖酵解酸化之差反映了細(xì)胞的糖酵解最大能力。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的非糖酵解酸化、糖酵解水平、糖酵解儲備、糖酵解最大能力分別比正常皮膚成纖維細(xì)胞高出約1.9倍、2.3倍、1.6倍和2.1倍(圖5)。

2.4 抑制PKM2后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖活性

應(yīng)用PKM2抑制劑(PKM2-IN-1)處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后，其增殖受到抑制，且呈濃度依賴性。分別用0、0.5、2 μmol/L的PKM2抑制劑處理細(xì)胞24 h后，統(tǒng)計成纖維細(xì)胞EdU陽性率。結(jié)果顯示，空白對照組與條件對照組中瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞EdU陽性率無統(tǒng)計學(xué)差異，實(shí)驗組EdU陽性率相比條件對照組(0 μmol/L)明顯下降，低濃度(0.5 μmol/L)時即表現(xiàn)出了明顯的抑制作用，中濃度(2 μmol/L)時細(xì)胞增殖率下降超過50%；選用藥物濃度2 μmol/L的PKM2抑制劑分別作用于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，CCK-8結(jié)果顯示瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長曲線顯著下降(圖6)。

2.5 抑制PKM2后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞糖酵解功能

如圖7所示，應(yīng)用PKM2抑制劑(PKM2-IN-1)處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后，其產(chǎn)酸水平顯著降低，且隨PKM2抑制劑濃度增加，而逐漸下降。其中瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的非糖酵解酸化并未表現(xiàn)出明顯變化；糖酵解水平分別下降至對照組(0 μmol/L)的0.77倍(0.5 μmol/L)、0.37倍(1 μmol/L)、0.23倍(2 μmol/L)；糖酵解儲備分別下降至對照組(0 μmol/L)的0.72倍(0.5 μmol/L)、0.12倍(1 μmol/L)、0.002倍(2 μmol/L)；糖酵解的最大能力分別下降至對照組(0 μmol/L)的0.76倍(0.5 μmol/L)、0.33倍(1 μmol/L)、0.19倍(2 μmol/L)。

A：ECAR曲線；B：非糖酵解酸化；C：糖酵解水平；D：糖酵解最大能力；E：糖酵解儲備(*：P<0.05)A: ECAR curve; B: Non-glycolysis acidification; C: Glycolysis; D: Glycolytic maximum capacity; E: Glycolysis reserve(*: P<0.05)圖5 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與正常皮膚成纖維細(xì)胞糖酵解壓力測試Fig. 5 Glycolysis stress test of KFs and NFs

A：EdU熒光染色；B：EdU陽性細(xì)胞比例統(tǒng)計；C：CCK-8法測定細(xì)胞生長曲線(*：P<0.05；***： P<0.001)A: EdU staning; B: Quantitative EdU positive cell rates; C: CCK-8 showed the proliferation vitality of KFs(*：P<0.05；***： P<0.001)圖6 PKM2-IN-1對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響Fig. 6 Effect of PKM2-IN-1 on proliferation in KFs

2.6 抑制PKM2后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)水平

加入不同濃度PKM2抑制劑后，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平隨著PKM2抑制劑濃度增加而顯著減少，Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平并無明顯變化(圖8)。

A：ECAR曲線；B：非糖酵解酸化；C：糖酵解水平；D：糖酵解最大能力；E：糖酵解儲備(P-IN-1：PKM2-IN-1；**： P<0.01；***： P<0.001)A: ECAR curve; B: Non-glycolysis acidification; C: Glycolysis; D: Glycolytic maximum capacity; E: Glycolysis reserve (P-IN-1: PKM2-IN-1; **： P<0.01; ***： P<0.001)圖7 PKM2-IN-1對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞糖酵解的影響Fig. 7 Effect of PKM2-IN-1 on glycolysis metabolism in KFs

A：Western-blot檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)； B：Ⅰ型膠原灰度值分析；C：Ⅲ型膠原灰度值分析(***： P<0.001)A: Expression of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ by Western blot; B: Grayscale analysis of collagen Ⅰ; C: Grayscale analysis of collagen Ⅲ (***： P<0.001)圖8 PKM2-IN-1對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原合成的影響Fig. 8 Effect of PKM2-IN-1 on collagen synthesis in KFs

3 討論

近年來，瘢痕疙瘩的治療取得了極大的進(jìn)展，但其形成機(jī)制仍未完全闡明?！澳[瘤”類型瘢痕疙瘩具有明顯的腫瘤臨床特征，同時伴有癌基因激活，提示瘢痕疙瘩具有腫瘤相關(guān)特性。既往的研究顯示，瘢痕疙瘩具有與腫瘤相似的糖代謝相關(guān)改變[8，15-16]，但目前研究成果較少，且未針對某一特定靶點(diǎn)進(jìn)行闡述。

本研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞糖酵解功能上調(diào)，其糖酵解水平與糖酵解最大能力也顯著增高。PKM2在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中高表達(dá)；在抑制PKM2后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞糖酵解功能下調(diào)，并隨抑制劑濃度增高，其糖酵解功能的下調(diào)作用越明顯。意味著瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中高表達(dá)的糖酵解關(guān)鍵基因PKM2可調(diào)控其糖代謝改變。寡霉素是ATP合成抑制劑，可抑制線粒體呼吸并將能量更多地轉(zhuǎn)移進(jìn)糖酵解通路。經(jīng)寡霉素處理后出現(xiàn)糖酵解儲備意味著在模擬線粒體氧化通路阻斷后，糖酵解的代償能力增加。本研究中，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的糖酵解儲備增高并未顯示出顯著性，可能是瘢痕疙瘩患者具有個體差異及樣本量有限所致?？紤]到其糖酵解水平及糖酵解最大能力均顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，我們?nèi)哉J(rèn)為瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的糖酵解活性是上調(diào)的。細(xì)胞非糖酵解酸化中包括其他生化途徑產(chǎn)生的酸性物質(zhì)，例如CO2溶于水形成的酸。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞非糖酵解酸化率顯著性增高，說明在糖酵解之外，其他代謝途徑可能也存在上調(diào)情況。抑制PKM2對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的非糖酵解酸化率影響沒有顯著改變，進(jìn)一步說明PKM2是糖酵解關(guān)鍵基因，對其他代謝通路沒有顯著影響。

PKM1與PKM2都由PKM基因編碼，通過PKM前體mRNA可變剪接，產(chǎn)生含有特異性外顯子9的PKM1和特異性外顯子10的PKM2[11]。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與正常皮膚成纖維細(xì)胞PKM1表達(dá)并無差異，PKM2表達(dá)顯著上調(diào)，說明PKM基因中PKM2尤為關(guān)鍵。

Ki67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)蛋白，定位于細(xì)胞核內(nèi)，其功能與有絲分裂密切相關(guān)。在細(xì)胞周期中的分裂間期其表達(dá)水平很低，而在有絲分裂期表達(dá)水平達(dá)到峰值。Ki67作為增殖相關(guān)標(biāo)志物之一，在臨床病理分析中應(yīng)用十分廣泛，因此本實(shí)驗對瘢痕疙瘩及正常皮膚組織切片進(jìn)行了Ki67的免疫組化染色及半定量分析。EdU是一種胸腺嘧啶核苷酸類似物，代替胸腺嘧啶參與DNA的復(fù)制。后續(xù)體外實(shí)驗中，CCK-8生長曲線可直觀顯示細(xì)胞數(shù)量變化，EdU摻入法可準(zhǔn)確反映DNA的復(fù)制水平，充分說明瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞具有更高的增殖活性且通過抑制PKM2可抑制其增殖。

Ⅰ、Ⅲ型膠原與傷口愈合關(guān)系密切。早期研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩組織Ⅰ、Ⅲ型膠原中的mRNA水平分別上調(diào)19.2倍和20.1倍[17]，而近期相關(guān)組織學(xué)研究顯示瘢痕疙瘩組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原比例為17∶1，遠(yuǎn)高于普通瘢痕的6∶1[18-19]。這說明Ⅰ型膠原的異常增多在瘢痕疙瘩形成中尤為關(guān)鍵。本研究顯示，隨著PKM2抑制劑濃度增高，Ⅰ型膠原纖維蛋白表達(dá)逐漸減少，Ⅲ型膠原纖維蛋白無明顯差異，兩者的比值下降。我們推測在瘢痕疙瘩中PKM2可能主要影響Ⅰ型膠原的合成，而兩者比例下降更是一個積極的結(jié)果。

本研究顯示，PKM2可以影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖、糖代謝及膠原合成，但其在瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制中的作用還有待于進(jìn)一步闡明。

綜上所述，PKM2在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，抑制PKM2可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的糖酵解功能、增殖以及膠原合成。本研究為揭示瘢痕疙瘩發(fā)病相關(guān)機(jī)制與治療藥物開發(fā)提供了新的思路及研究基礎(chǔ)。