可注射型華通膠光交聯(lián)水凝膠用于組織工程軟骨再生的實驗研究

徐松山 趙少華 菅炎鵬 劉偉杰 王一公 張偉

各種原因(如腫瘤、外傷、先天畸形等)引起的軟骨缺損臨床較為常見，但軟骨的自我修復(fù)能力極為有限，可嚴重影響患者生活質(zhì)量[1]。組織工程技術(shù)的快速發(fā)展為解決這一難題提供了新的思路[2]。組織工程技術(shù)有望通過自體細胞構(gòu)建出具有特定形狀、合適力學(xué)強度和生物學(xué)功能的理想軟骨組織，使患者獲得結(jié)構(gòu)和功能重建。理想的載體材料是組織工程軟骨構(gòu)建的關(guān)鍵之一。

研究表明，臍帶華通膠富含膠原、透明質(zhì)酸和糖胺聚糖等，且無血管分布、神經(jīng)支配和淋巴回流[3]。此外，華通膠可保護臍帶血管免受外力擠壓，從而保障正常的臍帶血運，該作用與關(guān)節(jié)軟骨緩沖受力，減少變形、損傷及摩擦的作用相似，故而華通膠在成分、結(jié)構(gòu)、功能上均與軟骨組織類似。因此，華通膠有望成為軟骨組織工程中載體材料的理想來源。

可注射的水凝膠在軟骨再生方面具有巨大的優(yōu)勢，如細胞或藥物可以均勻包裹在水凝膠內(nèi)，用于填充不規(guī)則缺損，水凝膠原位成形有利于水凝膠與組織的結(jié)合[4]。近年來，溫敏水凝膠已經(jīng)成功制備，但其凝膠化時間較長。光交聯(lián)水凝膠可以在軟骨缺損部位注射水凝膠前驅(qū)體并隨即快速凝膠化，在臨床上顯示出巨大的應(yīng)用前景。因此，光交聯(lián)水凝膠是軟骨組織工程中載體材料的理想形式。

本研究擬將華通膠制備成可注射的光交聯(lián)水凝膠，并對其進行流變學(xué)及溶脹率檢測；隨后復(fù)合軟骨細胞進行體外培養(yǎng)，觀察華通膠光交聯(lián)水凝膠的細胞相容性；最后將該軟骨細胞-華通膠光交聯(lián)水凝膠復(fù)合物植入裸鼠皮下培養(yǎng)2周和6周，以探索華通膠光交聯(lián)水凝膠用于構(gòu)建組織工程軟骨的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、實驗試劑及儀器

6周齡新西蘭白兔1只(上海甲干生物科技有限公司)，體質(zhì)量約2.5 kg，雌雄不限。6周齡BALB/c裸鼠6只(上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)，雌雄不限。本實驗遵守實驗動物倫理原則。

光交聯(lián)水凝膠引發(fā)器(華東理工大學(xué))，胰蛋白酶、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B、磷酸鹽緩沖液(Hyclone公司，美國)，木瓜蛋白酶溶液(Sigma，美國)，DNA含量檢測試劑盒(天根生化科技有限公司)，GAG阿爾新藍法檢測試劑盒(生工生物工程股份有限公司)，總膠原蛋白檢測試劑盒(北京博蕾德生物科技有限公司)。

流變儀(Anton-Paar MCR302，上海智鳶機電設(shè)備有限公司)，壓縮測試儀(Instron公司，美國)，核酸蛋白質(zhì)定量檢測器(Nanodrop2000，Thermo公司，美國)。

1.2 華通膠水凝膠的制備

收集新鮮健康的人臍帶(獲捐贈者知情同意，并經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準)。無菌條件下，去除臍帶內(nèi)的動靜脈，剝除臍帶外面的膜，可獲取膠凍樣的華通膠組織。把獲得的華通膠置于1 mol/L的NaOH溶液中，室溫條件下脫細胞處理4 h，乙酸調(diào)節(jié)pH值至7.0。將上述脫細胞后的華通膠加入勻漿機內(nèi)，然后加入5倍體積的無菌三蒸水，在4 ℃下進行充分攪拌粉碎，充分凍干后即可制成華通膠粉末。隨后將0.08 g光交聯(lián)水凝膠[5]和0.16 g華通膠粉末溶解在1 mL PBS中，置于37 ℃條件下充分混勻制成華通膠光交聯(lián)水凝膠。

1.3 華通膠光交聯(lián)水凝膠的流變學(xué)特性

用流變儀檢測華通膠光交聯(lián)水凝膠在室溫下的流變性能。用動態(tài)流變學(xué)法測定華通膠光交聯(lián)水凝膠在365 nm、30 mW/cm2紫外光下照射400 s的貯存模量(G′)和損耗模量(G″)。

1.4 華通膠光交聯(lián)水凝膠的溶脹率檢測

將l.0 mL按上述方法制備的華通膠光交聯(lián)水凝膠加入含有10 mL PBS的離心管中，分別于20、40、60、80和100 h后取出樣本并且記錄對應(yīng)體積，記為Vt，初始水凝膠體積記為V0，溶脹率定義為Vt/V0。每個樣本平行測量3次。

1.5 原代軟骨細胞的分離培養(yǎng)及擴增

無菌條件下取2月齡新西蘭兔的耳軟骨，用眼科剪將軟骨塊剪碎后加入Ⅱ型膠原酶，用吸管充分吹打混勻后，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中消化8 h；加入8 mL的H-DMEM培養(yǎng)液(含10% FBS，下同)終止消化，充分吹打混勻后收集至15 mL的離心管中，1 800 r/min離心5 min，棄上清，加入7 mL培養(yǎng)液，充分吹打混勻，取混懸液分至培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后進行首次換液，之后隔日換液。顯微鏡下觀察細胞生長情況，當細胞生長至培養(yǎng)瓶底部的70%～80%后，胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養(yǎng)。取第2代細胞備用。

1.6 軟骨細胞-華通膠光交聯(lián)水凝膠復(fù)合物體外構(gòu)建

將軟骨細胞制備成5.0×108個/mL的細胞混懸液，取100 μL混懸液與900 μL的華通膠光交聯(lián)水凝膠均勻混合，隨后用365 nm、30 mW/cm2紫外光照射90 s后加入含10%FBS的H-DMEM培養(yǎng)液至覆蓋復(fù)合物，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后進行活死細胞染色，熒光顯微鏡下觀察拍照。

將體外培養(yǎng)3 d的軟骨細胞-華通膠光交聯(lián)水凝膠復(fù)合物以4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋，切片(厚度為5 μm)，HE染色觀察軟骨細胞在水凝膠里的分布情況。

另外，將體外培養(yǎng)1、5、9 d的上述復(fù)合物，置于木瓜蛋白酶溶液中，65 ℃消化12 h。根據(jù)試劑盒方法，在乙醇提取和吸附柱吸附后，在洗脫緩沖液中回收基因組DNA。用核酸蛋白質(zhì)定量檢測器檢測DNA含量。

1.7 軟骨細胞-華通膠光交聯(lián)水凝膠復(fù)合物裸鼠體內(nèi)構(gòu)建軟骨

6只裸鼠麻醉后背部剃毛消毒，做1 cm皮膚切口，分離皮下組織形成一個小腔隙。將體外培養(yǎng)9 d的軟骨細胞-華通膠光交聯(lián)水凝膠復(fù)合物植入該腔隙中，縫合傷口。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，常規(guī)喂食，自由活動。分別于術(shù)后2周和6周取材，行大體觀察和組織學(xué)檢測。

體內(nèi)分別培養(yǎng)2周和6周的標本，進行大體觀察后將標本以4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋，切片(厚度為5 μm)，HE染色及Safranin-O染色觀察組織結(jié)構(gòu)及細胞外基質(zhì)分泌情況。用免疫組織化學(xué)的方法檢測Ⅱ型膠原(軟骨組織特異性細胞外基質(zhì))的表達情況，進一步證明構(gòu)建組織的軟骨表型[6]。

取體內(nèi)培養(yǎng)2周、6周的標本，修剪成直徑0.8 cm的圓形小塊，置于壓縮測試儀上，沿垂直氣管壁方向以1 mm/min的速度壓縮，直到樣本組織變形。記錄力與、位移曲線和最大拉斷力，并計算楊氏模量。

分別將體內(nèi)培養(yǎng)2周、6周及空白對照組(正常的新西蘭大白兔耳軟骨)的標本各50 mg置于木瓜蛋白酶溶液中，65 ℃消化12 h。根據(jù)試劑盒方法，用阿爾新藍法檢測硫酸化糖胺聚糖(GAG)含量[7]。在乙醇提取和吸附柱吸附后，在洗脫緩沖液中回收基因組DNA。用核酸蛋白質(zhì)定量檢測器檢測DNA含量。用羥脯氨酸測定法檢測總膠原含量。通過堿水解制備樣品，根據(jù)先前描述的方法測定游離羥脯氨酸水解產(chǎn)物[8]。以上所有樣品的分析重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 華通膠光固化水凝膠的流變特性和溶脹率

可注射的水凝膠應(yīng)該具有一定的流變學(xué)特性。檢測顯示華通膠光交聯(lián)水凝膠表現(xiàn)出剪切變稀行為(圖1A)，這對于可注射水凝膠的連續(xù)流動是必要的。此外，該水凝膠的存儲模量(G')隨著紫外照射時間的延長而增加(圖1C、1D)，表明該水凝膠是在光引發(fā)交聯(lián)后形成的，通過控制紫外光照射時間可以調(diào)節(jié)該水凝膠的存儲模量(G′)。溶脹率檢測顯示該水凝膠在20 h達到平衡溶脹狀態(tài)，最高溶脹率約為1.2(圖1B)。

A：水凝膠在25 ℃的黏度；B：水凝膠的溶脹率；C：水凝膠在不同時長紫外照射下的動態(tài)存儲模量和損耗模量； D：水凝膠在10、100、200 s時長紫外照射下的存儲模量 (*： P<0.05)A: Viscosity of the hydrogel at 25°C; B: Swelling ratio of the hydrogel; C: Dynamic modulus (G′and G″) of the hydrogel under UV irradiation at varying time; D: Storage modulus (G') of the hydrogels under UV irradiation at 10, 100, and 200 s (*: P<0.05)圖1 華通膠光交聯(lián)水凝膠的流變性質(zhì)及溶脹率Fig. 1 The rheological properties and swelling ratio of Wharton's jelly photo-crosslinking hydrogel

2.2 華通膠光交聯(lián)水凝膠的細胞相容性

良好的細胞相容性是水凝膠構(gòu)建組織工程軟骨的前提條件?；钏兰毎旧Y(jié)果顯示，在接種軟骨細胞后的第3天，軟骨細胞在華通膠光交聯(lián)水凝膠中能很好存活(圖2A)。DNA含量檢測結(jié)果也表明軟骨細胞在該水凝膠中能很好存活并且增殖，進一步說明該水凝膠具有良好的細胞相容性(圖2B)。此外，HE染色顯示軟骨細胞均勻分布于該水凝膠中(圖2C、2D)，有利于均質(zhì)的組織工程軟骨形成。

A：體外培養(yǎng)3 d后的活死細胞染色；B：DNA含量檢測；C、D：體外培養(yǎng)3 d后的HE染色A: Live & dead staining after in vitro culture for 3 days; B: DNA content analysis; C, D: HE staining after in vitro culture for 3 days圖2 華通膠光交聯(lián)水凝膠的細胞相容性檢測Fig. 2 The cytocompatibility of Wharton's jelly photo-crosslinking hydrogel

2.3 軟骨細胞-華通膠光交聯(lián)水凝膠復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)

裸鼠皮下培養(yǎng)2周后，大體觀察顯示軟骨細胞-華通膠光交聯(lián)水凝膠復(fù)合物形成瓷白色且略透明的軟骨樣結(jié)構(gòu)(圖3B)。隨著體內(nèi)培養(yǎng)時間延長至6周，該復(fù)合物形成更白且更加厚實的軟骨樣結(jié)構(gòu)，具有較好的彈性和韌性(圖3C)。體內(nèi)培養(yǎng)2周樣本進行組織學(xué)檢測，HE染色、Safranin-O染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色均較為淺淡，顯示有初步的軟骨結(jié)構(gòu)形成及稚嫩軟骨基質(zhì)的分泌(圖3D-F)，并能觀察到部分未降解的水凝膠成分。體內(nèi)培養(yǎng)6周樣本進行組織學(xué)檢測，HE染色、Safranin-O染色均呈現(xiàn)強烈的深染，顯示大量軟骨細胞外基質(zhì)和均勻的特異性軟骨陷窩形成，Ⅱ型膠原免疫組化進一步證明了所構(gòu)建的組織為均勻的軟骨組織(圖3G-I)。此時水凝膠成分均完全降解，表明所得組織為純粹的新生軟骨。

如圖4所示，生物力學(xué)(楊氏模量)和生物化學(xué)(DNA含量、GAG含量和總膠原含量)的結(jié)果進一步證實，隨著體內(nèi)培養(yǎng)時間延長(由2周至6周)，新生軟骨質(zhì)量逐漸提高且接近天然軟骨(P<0.05)。

A：光照后的軟骨細胞-華通膠光交聯(lián)水凝膠復(fù)合物大體觀；B：裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)2周后的大體觀； C：裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)6周后的大體觀；D-F：裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)2周后的HE染色、Safranin-O染色和Ⅱ型膠原染色； G-I：裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)6周后的HE染色，Safranin-O染色和Ⅱ型膠原染色(紅色箭頭表示未降解的水凝膠)A: Gross view of chondrocyte-hydrogel construct after UV crosslinking; B: Gross view of neocartilage after 2 weeks' in vivo culture; C: Gross view of neocartilage after 6 weeks' in vivo culture; D-F: HE, Safranin-O and type Ⅱ collagen immunohistochemistry staining of neocartilage after 2 weeks' in vivo culture; D-F: HE, Safranin-O and type Ⅱ collagen immunohistochemistry staining of neocartilage after 6 weeks' in vivo culture (Red arrows: residual hydrogel)圖3 裸鼠體內(nèi)軟骨再生Fig. 3 Cartilage regeneration in vivo

A：楊氏模量；B：DNA含量；C：GAG含量；D：總膠原含量(*：P<0.05)A: Young's modulus; B: DNA content; C: GAG content; D: Total collagen content(*: P<0.05)圖4 新生軟骨生物力學(xué)和生物化學(xué)檢測Fig. 4 Biomechanical and biochemistry analyses of neocartilage

3 討論

臍帶華通膠在成分、結(jié)構(gòu)、功能上均與軟骨組織非常類似，被認為是軟骨組織工程中支架材料的理想來源。此外，臍帶華通膠還具有以下特點：①支持華通膠間充質(zhì)干細胞的增殖，推測也能支持其他干細胞增殖；②華通膠中透明質(zhì)酸廣泛表達CD44受體，而軟骨細胞也表達CD44，使得軟骨細胞能緊緊黏附在華通膠上；③華通膠是多肽生長因子儲存庫，這些生長因子有利于細胞的增殖分化及細胞外基質(zhì)的重塑；④臍帶是分娩廢棄物，不涉及倫理問題，來源豐富[9-11]。因此，華通膠可作為組織工程軟骨構(gòu)建的載體材料成分。

水凝膠是一類高度含水的具有三維網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)結(jié)構(gòu)的聚合物材料，由于其優(yōu)異的生物相容性及一定的機械強度，可以高度擬合生物組織的微環(huán)境，因此廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)[12-13]。在臨床應(yīng)用中，原位固化的水凝膠具有優(yōu)異的組織賦形能力。光交聯(lián)水凝膠相對于溫敏和雙組分水凝膠，由于具有時空精確可控的優(yōu)勢而更具備臨床的實際操作性。本研究采用的光固化水凝膠，具有成膠快速(90 s)且力學(xué)強度優(yōu)秀的特點，是組織工程軟骨理想的載體材料形式[5]。

本研究成功制備出華通膠光交聯(lián)水凝膠，適宜的流變特性使其具有可注射能力。此外，該水凝膠還具有良好的細胞相容性，因其主要成分(包括華通膠、明膠和透明質(zhì)酸)均為具有良好細胞相容性的天然成分或材料。本研究中，我們將軟骨細胞-華通膠光交聯(lián)水凝膠復(fù)合物植入裸鼠皮下，6周后形成了瓷白色的典型軟骨樣組織，組織學(xué)顯示具有典型的軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，免疫組化染色證明其為Ⅱ膠原軟骨基質(zhì)成分。同時，軟骨特異性基質(zhì)定量及生物力學(xué)檢測結(jié)果均顯示，裸鼠皮下再生的軟骨組織接近天然軟骨。以上結(jié)果可能得益于：①華通膠中所含的天然成分，為軟骨再生提供了理想的微環(huán)境；②水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為軟骨細胞增殖和基質(zhì)分泌提供了良好的空間環(huán)境；③裸鼠皮下豐富的毛細血管可為軟骨細胞-華通膠光交聯(lián)水凝膠復(fù)合物提供物質(zhì)交換的動力。

綜上所述，華通膠光交聯(lián)水凝膠可作為一種理想成分和形式的載體材料用于組織工程軟骨構(gòu)建，適宜的流變特性使其具有可注射能力，優(yōu)秀的成膠能力有利于其塑形及組織整合，良好的細胞相容性有利于體內(nèi)環(huán)境軟骨再生。下一步我們將基于該華通膠光交聯(lián)水凝膠對膝關(guān)節(jié)軟骨缺損進行修復(fù)，以期實現(xiàn)其功能性重建。這種理想的載體材料，可能會為臨床大塊軟骨缺損的治療提供一種新的方法。