噬菌體在細菌耐藥性傳播中的作用及分子機制

顧佶麗，何濤，魏瑞成，王冉*

(1.南京農業(yè)大學動物科技學院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農業(yè)科學院農產品質量安全與營養(yǎng)研究所/省部共建重點實驗室—江蘇省食品安全重點實驗室，江蘇 南京 210014)

抗生素在對抗細菌感染性疾病的過程中發(fā)揮了巨大作用，然而隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，細菌對其產生了耐藥性。與細菌本身具有的天然耐藥性不同[1]，這種耐藥性是通過染色體的突變，或者整合外源的抗生素耐藥基因(ARGs)獲得的，也叫做獲得性耐藥[2]。ARGs的水平轉移可以通過三種機制實現：轉化(transformation)、接合轉移(conjugation)以及轉導(transduction)。其中接合轉移和轉導都需要借助于可移動遺傳元件(mobile genetic elements,MGEs)實現。根據其行為特征可以將介導耐藥性水平轉移的MGEs分為兩種主要類型：一類是可以在細菌宿主染色體外獨立進行復制并傳播的,這一類最經典的代表就是質粒(plasmid)，也是目前最受關注的MGEs，它在細菌耐藥性的水平轉移和擴散中發(fā)揮了巨大作用,另外一類MGEs則需要整合到宿主基因組DNA上以維持其穩(wěn)定存在，包括整合子、插入序列、轉座子、基因島、整合性接合轉移元件(ICEs)以及噬菌體等。質粒、整合子和基因島等MGEs在耐藥基因傳播過程中的重要性已經得到了人們的廣泛認識，而對于噬菌體在耐藥基因轉移和擴散中的貢獻關注較少。因此，本文主要對噬菌體在耐藥性傳播中的作用及其分子機制進行綜述。

1 噬菌體的定義及類型

噬菌體是一種感染細菌的病毒，英文名稱為“bacteriophage”，簡稱“phage”，意思是“吃細菌的病毒”。它們的基因組DNA或RNA被包裹在蛋白成分的衣殼(capsid)內部，因能引起宿主菌的裂解，故稱為噬菌體。它在自然界的數量龐大，存在于細菌的各個生存環(huán)境中[3-5]，如海洋、淡水、土壤、植物葉層和根圍、動物養(yǎng)殖環(huán)境、受人類活動影響的環(huán)境(如污水處理廠)以及人類腸道，甚至是極端環(huán)境中(表1)。從數量來說，自然界中噬菌體的總數估計超過了1030甚至1032，尤其以海洋中最為豐富。噬菌體可以分為裂解性(lytic)和溫和性(temperate)兩種：裂解性噬菌體可以特異性地感染某些細菌，利用細菌宿主合成自身的DNA以及蛋白進行包裝后形成子代噬菌體，最后細菌宿主被裂解而子代噬菌體釋放出來。溫和性噬菌體，也叫溶原性(lysogenic)噬菌體，大多情況下其DNA整合到宿主的染色體DNA上，這個過程也叫溶原轉換，隨著宿主DNA的復制一起進行復制，而噬菌體中對細菌有害的基因不會表達，這種整合到宿主染色體上的噬菌體也叫做前噬菌體(prophage)，攜帶前噬菌體的細菌叫做溶原菌(lysogen)。有部分前噬菌體，如P1、N15，LE1，φ20和 φBB-1，并不整合到宿主染色體上而以環(huán)狀或線性的質粒形式存在于宿主細胞內。能夠發(fā)生溶原轉換的噬菌體一般可以編碼轉錄抑制因子和整合酶等基因。在某些環(huán)境壓力(紫外線、抗生素壓力等)條件下發(fā)生溶原的前噬菌體可以從細菌宿主中釋放出來，這個過程叫做誘導(induction)，此時噬菌體進入裂解期，宿主菌裂解死亡而子代噬菌體釋放出來。但是如果前噬菌體中涉及溶原-裂解轉換功能的基因或是某些表達結構蛋白的基因丟失，從而造成前噬菌體不能從宿主菌中誘導出來，這種不可誘導前噬菌體的DNA序列會長期存在于細菌基因組中。細菌基因組中的前噬菌體是否具有完整的功能活性，可以通過在線預測軟件Prophage Hunter(https://pro-hunter.bgi.com/)和PHAST(http://phast.wishartlab.com/)進行預測。

表1 環(huán)境中噬菌體的豐度

2 前噬菌體及其分布

目前除了一些在實驗室偶然發(fā)現的經典前噬菌體外(λ，P1,P2,P4,P22,N15)，系統(tǒng)性研究表明前噬菌體在細菌中廣泛存在，這些前噬菌體有些具有功能活性，可以被誘導出來。如75%的化膿性鏈球菌中攜帶至少一個前噬菌體；Osawa等[6]從51株致病性大腸桿菌中發(fā)現了27個不同的攜帶志賀氏菌毒素的前噬菌體；Schicklmaier等[7-8]發(fā)現107株大腸桿菌中有83株可以誘導出至少一個前噬菌體，173株沙門氏菌中有136株可以釋放出前噬菌體，而實驗室常用的沙門氏菌LT2攜帶了4個完整的、具有功能的前噬菌體；有研究表明使用米諾環(huán)素C可以從170個耶爾森菌屬中誘導出7個具有功能的前噬菌體，以及從68個革蘭氏陽性奶牛源鏈球菌中誘導出38個前噬菌體或噬菌體樣顆粒。另有研究表明利用探針雜交的方法可以在同一種屬的多株細菌中檢測到同一特定的前噬菌體。據統(tǒng)計，某些細菌中前噬菌體基因組(包括完整和不完整)的含量可以高達10%～20%，不同細菌種屬含有的前噬菌體數量也不相同，如金黃色葡萄球菌基因組中大概有1～4個前噬菌體，某些大腸桿菌中前噬菌體的數量達到了20個。細菌基因組中前噬菌體普遍存在，這些前噬菌體極大地豐富了細菌的基因組內容，對細菌基因組的多樣性和細菌的進化發(fā)揮了重要作用，其中就包括細菌耐藥基因的獲得和傳播，從而使其適應外界復雜的生存環(huán)境。

3 噬菌體在耐藥性傳播中的作用

早在19世紀50年代，就發(fā)現噬菌體可以轉移細菌(主要是大腸桿菌和沙門菌)染色體或質粒上的ARGs，這個過程稱為轉導(transduction)。相對于介導ARGs轉移的其它方式(質粒、整合子、轉座子等)，轉導發(fā)生的頻率相對較低，且不同細菌種屬差異較大，如在金黃色葡萄球菌和鏈球菌中轉導頻率達到10-5～10-6，而在大腸桿菌、沙門菌等革蘭陰性菌中轉導頻率則為10-5～10-10，而質粒等移動元件的轉移頻率可以達到10-1～10-3，因此由噬菌體轉導方式介導的ARGs水平轉移受到的關注較少。盡管如此，由于噬菌體結構簡單，容易在環(huán)境中長期存活并可以對抗各種(DNA酶、溫度和輻射)環(huán)境壓力[9]，因此，它可以作為自然環(huán)境中耐藥基因轉移的最合適載體；并且環(huán)境中噬菌體數量巨大，不需要借助細菌與細菌之間的接觸就可以傳遞遺傳物質，因此轉導在自然界中可能隨時隨地發(fā)生，其在耐藥性傳播中的作用遠遠超出我們的想象。噬菌體不僅可以和ARGs共存于同一生態(tài)環(huán)境和同一細菌中，并且通過體外實驗證明了某些ARGs可以通過噬菌體在同一種屬細菌甚至不同種屬細菌之間傳遞。

3.1 噬菌體與耐藥基因的共存現象

目前在多種細菌的前噬菌體中發(fā)現了抗生素耐藥基因(表2)：如在大腸桿菌和沙門菌中發(fā)現了P1-like噬菌體并分別攜帶了blaSHV-2和blaCTX-M-27β-內酰胺酶基因[2,10]；在豬源大腸桿菌和人醫(yī)臨床肺炎克雷伯菌中發(fā)現P7-like噬菌體并攜帶了多黏菌素耐藥基因mcr-1[11-12]；在西班牙某醫(yī)院分離到的多個腸桿菌科細菌中發(fā)現超廣譜β-內酰胺酶基因blaCTX-M-10與噬菌體遺傳元件存在偶聯(lián)關系[13]；化膿性鏈球菌中的大環(huán)內酯類耐藥基因mefA位于58.8 kb的轉座子上，該轉座子插入到了該菌的前噬菌體中[14]；攜帶四環(huán)素耐藥基因tet(M)的Tn916-like轉座子元件在肺炎鏈球菌的前噬菌體中被發(fā)現[15]；炭疽桿菌前噬菌體中攜帶了對磷霉素耐藥的基因[16]。隨著宏基因組測序和實時熒光定量PCR(qPCR)技術的發(fā)展，ARG被發(fā)現存在于多種環(huán)境來源的噬菌體DNA上，包括活性污泥、城市污水和河流、醫(yī)院廢水、污水處理廠廢水以及土壤中，如有學者使用了qPCR的方法檢測了城市污水和河水樣本中噬菌體DNA中的耐藥基因，結果檢測到了兩種β-內酰胺酶耐藥基因(blaTEM和blaCTX-M)以及青霉素結合蛋白基因mecA[17]；另有研究表明醫(yī)院和城市廢水中的噬菌體DNA中含有高水平的β-內酰胺酶基因(blaTEM,blaCTX-M和blaSHV)和喹諾酮類耐藥基因(qnrA,qnrB和qnrS)[18]；最近的一個研究證明了被糞便污染的水體中分離的噬菌體DNA含有喹諾酮耐藥基因qnrA和qnrS，并且對水體進行螯合劑(EDTA或枸櫞酸鈉)的處理可明顯增加噬菌體DNA中耐藥基因的數量[19]；Muniesa等[20]在城市污水中發(fā)現了攜帶blaOXA-2,blaPSE-1、blaPSE-4以及blaPSE-type基因的病毒顆粒；除了生活環(huán)境，在人類的腸道、肺部的病毒組中也檢測出了多個抗生素耐藥基因。本實驗室收集了NCBI數據庫上發(fā)表的8 263個完整的噬菌體基因組序列，通過深入分析發(fā)現有20個(0.24%)噬菌體攜帶了β-內酰胺類耐藥基因，間接說明了噬菌體可能在耐藥基因的傳播過程中發(fā)揮作用。

表2 噬菌體中存在的耐藥基因

3.2 噬菌體介導的耐藥基因轉移證據

與質粒、整合子、轉座子、基因島和ICEs不同，噬菌體不需要細菌之間接觸就可以傳遞遺傳物質。目前已有多篇噬菌體轉移耐藥基因的文獻報道，噬菌體在轉移耐藥基因進入受體菌的同時，賦予受體菌相應的耐藥表型(表3)。噬菌體轉導耐藥性可以在同種屬細菌的不同菌株之間進行，如P22及P22-like噬菌體可以介導耐藥基因簇在鼠傷寒沙門菌DT104菌株之間轉移[8,21]。四環(huán)素耐藥基因和氯霉素-大環(huán)內酯類-林可霉素-克林霉素耐藥基因可以通過溶原性噬菌體在臨床化膿性鏈球菌菌株間水平轉移[22]。亞胺培南、頭孢他啶和氨曲南耐藥基因可以通過溶原性噬菌體轉移至銅綠假單胞菌臨床株[23-24]。ΦC2 可介導編碼紅霉素耐藥基因erm(B)的轉座子Tn6215在艱難梭菌之間傳播[25]。溫和性噬菌體Aa phi ST1可介導四環(huán)素耐藥轉座子Tn916在放線桿菌之間傳遞[26]。耐藥性轉導在葡萄球菌尤其是金黃色葡萄球菌中比較普遍，如金葡菌前噬菌體φ11，φ80 和 φ80α可對攜帶mecA基因的I型SCCmec遺傳元件進行包裝，從而能夠在不同金葡菌之間轉移mecA基因[27]；噬菌體φ80α等不僅可介導青霉素和四環(huán)素耐藥基因向金黃色葡萄球菌流行株USA300傳播，還可以介導耐藥基因向噬菌體不敏感的金葡菌轉移[28-29]。噬菌體介導耐藥基因轉移不僅可以在同種屬細菌之間發(fā)生，還可以在不同屬細菌之間進行，如P1及P1-like噬菌體可以介導耐藥基因或耐藥質粒在大腸桿菌之間或大腸桿菌與豬霍亂沙門氏菌之間進行轉移[21,30-31]；四環(huán)素耐藥性可以通過溶原性噬菌體從豬源雞腸球菌轉移至糞腸球菌，慶大霉素耐藥性也可以通過溶原性噬菌體從豬源糞腸球菌轉移至屎腸球菌、希氏/堅韌腸球菌和酪黃腸球菌中[32]。噬菌體φOT8可介導耐藥質粒在沙雷菌之間或沙雷氏菌和成團泛菌之間進行傳播[33]；噬菌體Φm46.1可以介導耐藥基因mef(A)和tet(O)從化膿性鏈球菌向無乳鏈球菌和戈登鏈球菌轉移[34];噬菌體φ879可介導四環(huán)素和氨基糖苷類耐藥質粒在松鼠葡萄球菌之間以及從松鼠葡萄球菌向金黃色葡萄球菌轉移[35]；金葡菌前噬菌體可以介導鏈霉素耐藥基因以高頻率在金黃色葡萄球菌之間或從金葡菌向單增李斯特菌傳播[27]。

表3 噬菌體轉導的耐藥基因

3.3 噬菌體轉移耐藥基因的分子機制

噬菌體轉移耐藥基因是通過轉導方式進行的，目前有三種轉導方式：特異性轉導(specialized transduction)、普遍性轉導(generalized transduction)和側向轉導(lateral transduction)。

特異性轉導又稱為局限性轉導，這種轉導方式只能轉移特定的基因片段到受體菌中，目前發(fā)現只能由溫和性噬菌體介導。發(fā)生特異性轉導的噬菌體一般整合到宿主菌的特定位點，在裂解宿主菌的過程中，噬菌體將整合位點附近的宿主DNA包裝進自己的衣殼顆粒中，這種包裝錯誤的噬菌體感染受體菌并將外源DNA整合到受體菌染色體上，此時特異性轉導發(fā)生。一般來說，那些能夠通過“cos”機制切割和包裝DNA，產生單位長度衣殼化DNA分子的噬菌體(如λ，T7)負責特異性轉導，在該轉導過程中，宿主的基因組DNA和噬菌體DNA是共價地結合在一起的，與噬菌體DNA一起進行復制、包裝和導入到受體細菌中。由于細菌基因組上與“cos”位點同源的序列很少，因此，特異性轉導只能轉移特定的細菌基因組片段到受體菌中，所以該轉導方式發(fā)生的頻率較低。

普遍性轉導能轉移細菌基因組的任何DNA片段到受體細菌中，即轉移的宿主基因具有隨機性，一般通過溫和性噬菌體介導，但也有報道表明經過突變的裂解性噬菌體T4也可發(fā)生普遍性轉導。噬菌體感染宿主菌后，可以產生兩種類型的子代病毒顆粒，一種為只包含噬菌體DNA的顆粒，一種為錯誤包裝宿主DNA片段的顆粒，也叫做轉導顆粒(transducing particles)。這些轉導顆粒除了衣殼蛋白是來源于噬菌體的，其包裝的DNA全部來自細菌基因組，因此，其攜帶外源DNA的容量較大。轉導顆粒如果成功感染某些細菌，可以將其中包裝的DNA片段帶入受體菌中，受體菌通過重組機制將外源基因整合到自身的染色體上，此時普遍性轉導完成。另有一種情況是被包裝的DNA片段是質粒，該質粒通過轉導進入受體菌中會發(fā)生環(huán)狀化，形成環(huán)狀的質粒，因此普遍性轉導除了可以轉移基因片段外，還可以水平轉移耐藥質粒。發(fā)生普遍性轉導的噬菌體通過滿頭(headful)包裝機制包裝基因組，一般這些噬菌體(如P1、P22、T4)在特異性位點(pac位點)切割自己的基因組并最大能力地包裹它們的DNA到噬菌體衣殼中。一般細菌基因組中具有多個與pac同源的位點,一旦這些pac同源位點被噬菌體“錯誤”識別并切割，就有可能將細菌DNA包裝在噬菌體衣殼中，形成可轉導噬菌體顆粒。外源基因能否在受體菌中穩(wěn)定存在取決于該DNA序列整合到細菌基因組中的能力，即發(fā)生重組(同源重組、異常重組和位點特異性重組)的幾率，而這些是由前噬菌體中攜帶的重組酶、整合酶或者外源基因上存在的轉座酶或拓補異構酶等因素共同決定的。普遍性轉導還有一種情況，它不僅可以使攜帶前噬菌體的溶原菌獲得競爭者的基因片段，同時可以殺死競爭者，從而有利于自身克隆的增殖，這種機制叫做自我轉導(auto-transduction)，有研究表明該機制可以增加金葡菌獲得耐藥基因的幾率[33]。

Chen等[37]最新研究發(fā)現金黃色葡萄球菌溫和噬菌體參與了一種特殊的轉導形式：側向轉導，在該過程中葡萄球菌前噬菌體不遵循經典的切除-復制-包裝途徑，而是噬菌體的切除過程往后延遲，在復制和包裝過程后進行。細菌基因組上的前噬菌體通過原位的DNA復制，可以產生多個前噬菌體基因組拷貝，隨后噬菌體在包裝DNA的過程中，可以同時形成成熟的噬菌體以及具有轉導能力的噬菌體顆粒，因此極大地提高了轉導效率，該方式可以將金黃色葡萄球菌基因組中上百kb大小的片段以非常高的頻率包裝在噬菌體的頭部，因此被認為是一種最有效的轉移耐藥基因的方式，該種轉導方式目前僅在金黃色葡萄球菌中報道。

在以上三種轉導方式中，普遍性轉導是最主要的方式，它發(fā)生的頻率在10-5～10-10之間，有時高達10-1(表3)。這種轉導方式可以在同一種屬細菌的不同菌株中發(fā)生，也可以在不同細菌種屬中發(fā)生，因此普遍性轉導在耐藥基因的跨種屬傳播中發(fā)揮了重要作用。特異性轉導轉移耐藥基因的機率很小，主要原因是噬菌體的整合位點主要位于細菌的核心基因組(core genome)上，而耐藥基因一般位于細菌基因組的可變區(qū)域(accessory genome)，同時特異性轉導發(fā)生的頻率較低(<10-9)，因此該種轉導方式對耐藥基因轉移的影響可以忽略。值得注意的是，在金黃色葡萄球菌中，特異性轉導方式在其染色體基因島(PICIs)的轉移過程中作用較大，而PICIs可同時攜帶毒力基因和多種耐藥基因(如β-內酰胺酶、氨基糖苷類、磷霉素、夫西地酸等耐藥基因)，因此普遍性轉導和特異性轉導方式均對金葡菌耐藥性的獲得和傳播發(fā)揮重要作用。側向轉導轉移基因片段的大小和效率最高，因此被認為是最有效的轉移耐藥基因的方式，但是由于其僅在金黃色葡萄球菌中發(fā)現和報道，該種方式在其它種屬細菌中轉移耐藥基因的潛力還有待進一步研究才能明確。對于轉導來說，噬菌體宿主譜是一個影響耐藥基因在細菌之間傳播的主要限制因素，這是由噬菌體尾絲蛋白識別細菌宿主的特異性決定的。由于革蘭陽性菌噬菌體的宿主譜相對廣泛，因此推測噬菌體對耐藥基因在革蘭陽性菌中的傳播作用要大于革蘭氏陰性細菌。

3.4 噬菌體對腸道菌群的影響

噬菌體作為細菌的“自然天敵”，具有來源廣泛、殺菌特異性強、殺菌效果好的優(yōu)點，因此在細菌感染尤其是耐藥菌的感染治療中具有巨大應用潛力。前面所述噬菌體介導的耐藥性轉移和傳播作用主要是由溫和性噬菌體介導的，因此裂解性噬菌體在耐藥菌的生物防控中仍具有應用價值。盡管如此，仍需要系統(tǒng)考察噬菌體在應用過程中，尤其是在腸道疾病治療過程中可能對腸道菌群產生的影響。已有研究表明裂解性噬菌體通過作用于靶細菌，可波及到菌群中的其它非靶細菌成員及其代謝產物，從而對菌群造成廣泛影響[38]。同時，腸道細菌中具有和人類健康相關的噬菌體組(gut phageome)，這些噬菌體組對于腸道菌群穩(wěn)態(tài)的維持及耐藥基因腸道內傳播的貢獻如何，也是下一步需要研究的方向。

4 結論

噬菌體是自然界中數量極為豐富的生物體，它存在于細菌生存的各個生態(tài)環(huán)境，對細菌基因組的多樣性和進化發(fā)揮了重要作用。噬菌體結構簡單，容易在環(huán)境中長期存活并可以對抗各種環(huán)境壓力，因此它是耐藥基因轉移的最合適載體，對于耐藥基因的傳播和持留具有重要作用。同時，噬菌體不僅可以介導耐藥基因在同一種屬細菌之間傳播，還可以介導耐藥基因的跨細菌種屬傳播。因此，噬菌體在細菌耐藥性的發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。在上述研究基礎上，今后對于噬菌體/耐藥性關系可加強以下幾個方面的研究工作：從體內外探究噬菌體轉導耐藥基因的驅動因素及其作用機制，如抗生素壓力、炎癥等因素；比較不同類型(溫和性和裂解性)噬菌體在耐藥性轉移中的貢獻，從而充分評估裂解性噬菌體在治療中的安全性；深入研究噬菌體介導環(huán)境源耐藥基因轉移進入動物/人類共生菌以及致病菌過程中發(fā)揮的作用；建立科學的耐藥基因傳播擴散評估模型，充分考察噬菌體、質粒等可轉移元件在耐藥基因轉移中的貢獻。