阿魏酸聯(lián)合連翹苷對(duì)LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用

張弛，王惠文，崔常勇，劉丹丹，韓子逸，趙昕，劉明江,3*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.龍口海關(guān)，山東 煙臺(tái) 265700；3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

奶牛乳房炎是困擾奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病，目前抗生素療法仍然是該疾病的主要治療手段，但如今人類不得不面對(duì)細(xì)菌耐藥性帶來(lái)的威脅[1-2]。因此，對(duì)新型綠色抗菌劑的需求非常迫切，尤其是綠色獸用抗菌劑[3]。近年來(lái)，植物源酚類化合物因具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等多種活性吸引了研究者的廣泛關(guān)注[4-5]。阿魏酸 (ferulic acid,FA) 為酚類化合物，廣泛存在于植物細(xì)胞壁成分中[6]。連翹苷 (phillyrin,PHI) 是連翹的主要藥理成分，具有廣泛的藥理活性。已有研究指出，F(xiàn)A、PHI具有抗炎、抗菌、抗病毒等活性[7-9]，但未見(jiàn)FA或PHI在控制LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞 (bovine mammary epithelial cells,BMEC) 炎癥反應(yīng)方面的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)探討了FA聯(lián)合PHI對(duì)LPS誘導(dǎo)的BMEC炎性損傷的保護(hù)作用，為含有該類成分的中藥方劑防治大腸桿菌性奶牛乳房炎提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑：LPS(O55B5，美國(guó)Sigma公司)；DMEM-F12(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；0.25%胰酶-EDTA溶液(美國(guó)Gibco公司)；DMSO(美國(guó)Gibco公司)；Trizol(美國(guó)Invitrogen生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMEC原代培養(yǎng)

選取處于泌乳期且無(wú)隱性乳房炎的奶牛，采用外科手術(shù)方法在乳房基底部與乳頭連線中間部位釆取乳腺組織。用75%酒精沖洗乳腺組織外周1遍，然后用生理鹽水繼續(xù)沖洗干凈。將乳腺組織修剪成小塊后分離腺泡至離心管中，用含有雙抗 (200 U/mL) 的PBS清洗2～3遍，采用酶消化法得到細(xì)胞團(tuán)塊后置于細(xì)胞瓶中培養(yǎng)。24 h后換液，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)游出情況，待大量細(xì)胞游出后可傳代培養(yǎng)。使用3～4代細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后用完全培養(yǎng)液制備成5 × 104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按200 μL/孔均勻接種于96孔板并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后棄去原培養(yǎng)基并分別添加含有不同濃度FA、PHI的基礎(chǔ)培養(yǎng)基200 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8 (CCK8) 并于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，使用酶標(biāo)儀 (450 nm) 檢測(cè)各孔的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.3 試驗(yàn)分組與處理

將1 mL 細(xì)胞懸液(1 × 106個(gè)/mL)接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞90%融合后，分為空白對(duì)照組(Con)、模型組(LPS)、(FA15+LPS)組、(PHI5+LPS)組、低濃度聯(lián)合用藥組(FA5+PHI5+LPS)和高濃度聯(lián)合用藥組(FA15+PHI5+LPS)。Con組基礎(chǔ)培養(yǎng)基正常培養(yǎng)12 h；模型組基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入LPS(50 μg/mL)處理12 h；FA15+LPS組使用含有FA(15 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理2 h后加入含有LPS(50 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理12 h；PHI5+LPS組使用含有PHI(5 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理2 h后加入含有LPS(50 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理12 h；低濃度聯(lián)合用藥組使用含有FA(5 μg/mL)與PHI(5 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理2 h后加入含有LPS(50 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理12 h；高濃度聯(lián)合用藥組使用含有FA(15 μg/mL)與PHI(5 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理2 h后加入含有LPS(50 μg/mL)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理12 h。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)氧自由基(ROS)的檢測(cè)

將各組細(xì)胞按照試驗(yàn)要求處理后，加入胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，每組加100 μL PBS重懸細(xì)胞，并加入1 μL(10 μmol/L)ROS熒光探針(DCFH-DA)，混勻后在37 ℃避光反應(yīng)30 min，PBS洗滌2次后，每組加200 μL PBS重懸細(xì)胞，及時(shí)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。ROS水平以平均熒光強(qiáng)度表示。

1.2.5 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

將各組細(xì)胞按照要求處理后，加入胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，按凋亡試劑盒(美國(guó)BD公司)說(shuō)明書進(jìn)行染色后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[10]。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)炎癥因子表達(dá)的檢測(cè)

將各組細(xì)胞按照試驗(yàn)要求處理后，使用Trizol分別提取各組細(xì)胞的總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后按RT-PCR試劑盒(南京諾唯贊生物有限公司)說(shuō)明書操作，測(cè)定IL-1β、TNF-α、IL-6的Ct值，具體步驟參考文獻(xiàn)[10]。按2-ΔΔCt方法計(jì)算并分析。引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.7 試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)氧化還原指標(biāo)

將各組細(xì)胞按照試驗(yàn)要求處理后，使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白作為待測(cè)樣品，按試劑盒(南京建成生物有限公司)說(shuō)明書操作步驟測(cè)定胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度FA、PHI對(duì)BMEC活力的影響

如圖1A所示，F(xiàn)A在濃度1～60 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響，在濃度1～30 μg/mL范圍內(nèi)有顯著促細(xì)胞增殖作用(P<0.05)。PHI在濃度1～40 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響，在濃度1～20 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞有顯著促增殖作用(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。

注:與對(duì)照(0 μg/mL)相比，*P<0.05；**P<0.01圖1 不同濃度FA(A)、PHI(B)對(duì)BMEC活力的影響

2.2 FA聯(lián)合PHI對(duì)LPS誘導(dǎo)BMEC內(nèi)ROS水平的影響

如圖2所示，相比Con組，LPS組ROS水平極顯著升高 (P<0.001)；FA、PHI和聯(lián)合用藥組ROS水平較LPS組均極顯著降低 (P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組的效果優(yōu)于單獨(dú)用藥組。

2.3 FA聯(lián)合PHI對(duì)LPS誘導(dǎo)BMEC凋亡的影響

如圖3所示，LPS組較Con組細(xì)胞凋亡率極顯著升高 (P<0.001)；FA、PHI和聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率較LPS組均極顯著降低 (P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組的效果優(yōu)于單獨(dú)用藥組。

2.4 FA聯(lián)合PHI對(duì)LPS誘導(dǎo)BMEC炎性因子表達(dá)的影響

與Con組相比，LPS組細(xì)胞內(nèi)炎性因子IL-1β(圖4A)、IL-6(圖4B)、TNF-α(圖4C)表達(dá)極顯著升高 (P<0.001)；FA、PHI和聯(lián)合用藥組IL-1β、IL-6、TNF-α含量較LPS組均極顯著降低 (P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組的效果優(yōu)于單獨(dú)用藥組。

注：***P<0.001與Con組相比；與LPS組相比，##P<0.01，###P<0.001。下同圖2 FA聯(lián)合PHI對(duì)LPS誘導(dǎo)BMEC內(nèi)ROS水平的影響

A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)；B.細(xì)胞凋亡率分析圖3 FA聯(lián)合PHI對(duì)LPS誘導(dǎo)BMEC凋亡的影響

A.IL-1β；B.IL-6；C.TNF-α圖4 FA聯(lián)合PHI對(duì)LPS誘導(dǎo)BMEC內(nèi)炎性因子表達(dá)的影響

2.5 FA聯(lián)合PHI對(duì)LPS誘導(dǎo)BMEC內(nèi)SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

相比Con組，LPS組細(xì)胞內(nèi)SOD(圖5A)、GSH-Px(圖5B)活性極顯著降低，MDA含量(圖5C)極顯著升高 (P<0.001)，F(xiàn)A、PHI和聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性均顯著升高 (P<0.05)，MDA含量均極顯著降低 (P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組的效果優(yōu)于單獨(dú)用藥組。

注：與LPS組相比，#P<0.05圖5 FA聯(lián)合PHI對(duì)LPS誘導(dǎo)BMEC SOD(A)、GSH-Px(B)活性和MDA含量(C)的影響

3 討論

BMEC是抵御病原微生物的第一道防線，細(xì)胞間的緊密連接是維持血液和牛奶之間成分交換的重要結(jié)構(gòu)[11]。BMEC損傷和不受控制的“血-乳”成分交換引起的“炎癥風(fēng)暴”是導(dǎo)致乳腺功能異常和產(chǎn)奶量下降的關(guān)鍵因素[12]。大腸桿菌是奶牛乳房炎的常見(jiàn)致病菌之一，常誘導(dǎo)急性、劇烈的炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致乳腺明顯紅腫、疼痛及產(chǎn)奶量急劇下降等臨床癥狀[13-14]。前期研究表明，LPS能夠誘導(dǎo)BMEC劇烈的炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)并導(dǎo)致細(xì)胞損傷、凋亡[15]。本文對(duì)FA聯(lián)合PHI對(duì)LPS誘導(dǎo)的BMEC炎性損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了研究。

研究顯示，F(xiàn)A、PHI對(duì)BMEC具有較廣泛的細(xì)胞安全濃度范圍，且具有顯著的促細(xì)胞增殖作用，因此，選擇15 μg/mL、5 μg/mL的FA和5 μg/mL的PHI研究二者對(duì)LPS誘導(dǎo)的BMEC炎性損傷的協(xié)同保護(hù)作用。LPS誘導(dǎo)BMEC胞內(nèi)ROS含量和細(xì)胞凋亡率顯著升高，與前期研究相符；而FA、PHI單獨(dú)用藥組和聯(lián)合用藥組均可顯著降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平和細(xì)胞凋亡率，且聯(lián)合用藥的效果更優(yōu)。說(shuō)明FA聯(lián)合PHI對(duì)LPS誘導(dǎo)的BMEC氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。

炎癥與氧化應(yīng)激密不可分[16-17]。通過(guò)對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)炎癥因子、氧化還原指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A、PHI和聯(lián)合用藥組均顯著降低LPS誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)；顯著提高過(guò)氧化物分解酶 (SOD、GSH-Px) 的活性，減少氧化產(chǎn)物 (MDA) 的含量，且聯(lián)合用藥的效果更優(yōu)。說(shuō)明FA聯(lián)合PHI可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的BEMC炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而維持細(xì)胞活性。研究表明，F(xiàn)A、PHI對(duì)LPS誘導(dǎo)的BMEC炎性損傷具有協(xié)同保護(hù)作用，但具體的分子機(jī)制需進(jìn)一步的研究。

LPS可誘導(dǎo)BMEC產(chǎn)生大量的炎癥因子、ROS，并進(jìn)一步誘導(dǎo)外周血中吞噬細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)迅速活化并大量遷移至乳腺組織，通過(guò)“呼吸爆發(fā)”作用殺滅病原菌；但不受控制的炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)將導(dǎo)致“血乳”屏障破壞、乳腺組織損傷[18]。因此，F(xiàn)A、PHI通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的BMEC炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)，不僅保護(hù)了BMEC的結(jié)構(gòu)、功能，同時(shí)可減弱對(duì)外周血吞噬細(xì)胞的趨化作用，避免過(guò)度炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。本研究為含有該類成分的中藥或中藥制劑防治大腸桿菌性奶牛乳房炎提供了一定的理論依據(jù)。