韓國波,李英花,葉孟傲然,許永男,2*
(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133000;2.吉林省延邊黃牛種質(zhì)資源保護(hù)工程研究中心,吉林 延吉 133000)
卵母細(xì)胞的成熟是指卵母細(xì)胞在受到多種因素的影響下其活性得以激活,完成第一次減數(shù)分裂進(jìn)入到第二次減數(shù)分裂中期的過程,其中生發(fā)泡破裂(GVBD)是減數(shù)分裂恢復(fù)的標(biāo)志。卵母細(xì)胞開始減數(shù)分裂前的停滯和從MI到MII是其減數(shù)分裂的兩個非常重要的時期,也是阻礙其成熟的兩個主要原因[1-2]。Chk1是細(xì)胞周期中的一套保證DNA復(fù)制和染色體分配質(zhì)量的檢查機(jī)制,是一類負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。當(dāng)細(xì)胞周期進(jìn)程中出現(xiàn)異常事件,如DNA損傷或DNA復(fù)制受阻時,這類調(diào)節(jié)機(jī)制就被激活,及時地中斷細(xì)胞周期的運(yùn)行,待細(xì)胞修復(fù)或排除故障后,細(xì)胞周期才能恢復(fù)運(yùn)轉(zhuǎn)[3-4]。研究Chk1在豬卵母細(xì)胞中的表達(dá)和定位及其對豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的影響,對于改善豬卵母細(xì)胞體外成熟具有重要意義。
有研究表明,Chk1對小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂前的停滯是必需的,消耗Chk1會加速小鼠卵母細(xì)胞的GVBD,其過表達(dá)會使小鼠卵母細(xì)胞紡錘體組裝檢查點(diǎn)(SAC)活化,并阻礙卵母細(xì)胞的成熟[5];而豬卵母細(xì)胞的成熟不需要Chk1,但Chk1的敲低會延緩卵母細(xì)胞的成熟,并對染色體的排列有影響[6]。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的重新開始與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)的活動密切相關(guān),Chk1可抑制細(xì)胞周期調(diào)控因子Cdc25,使CDK1和CDK2失活,DNA不能被復(fù)制;此外,它有助于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Wee1/Myt1)的磷酸化,使Wee1/Myt1更穩(wěn)定[7-8]。Chk1也在SAC調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用,在有絲分裂中SAC通過延緩姐妹染色單體分離,直到所有姐妹染色單體的著絲粒與兩極的紡錘絲相連接,來防止染色體的異常分離[9]。停在減數(shù)分裂初期的卵母細(xì)胞,其CDK1的活性由幾個因素調(diào)節(jié)而維持在較低程度。細(xì)胞周期蛋白B(Cyclin B)是CDK1相關(guān)蛋白,通過去磷酸化來激活CDK1;Cdc25磷酸酶在哺乳動物中包括Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C,負(fù)責(zé)CDK1的Thr14、Tyr15位點(diǎn)的去磷酸化來激活CDK1;Wee1/Myt1激酶家族通過磷酸化CDK1的Thr14和Tyr15位點(diǎn)負(fù)調(diào)控CDK1;Gwl激酶通過與ENSA/ARPP19相互作用抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)的激活,PP2A可負(fù)調(diào)節(jié)CDK1的活化。在G2中,由于CDK1在Thr14和Tyr15被Wee1/Myt1激酶家族磷酸化,因此,卵母細(xì)胞促成熟因子(MPF)被抑制,當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入M期時,磷酸酶Cdc25被激活,通過去磷酸化CDK1在Thr14和Tyr15的磷酸位點(diǎn)來激活CDK1,CDK1反過來磷酸化自己的調(diào)節(jié)器,從而增強(qiáng)Wee1/Myt1抑制和Cdc25激活[10-13]。
已知chir-124是一種基于喹諾酮的小分子,在結(jié)構(gòu)上與其他已知的Chk1抑制劑無關(guān),它在體外有效地和選擇性地抑制Chk1[14]。本研究采用chir-124代替向卵母細(xì)胞內(nèi)注射干擾RNA的方法來消耗Chk1,以進(jìn)一步研究Chk1對豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的影響,并為進(jìn)一步提高豬卵母細(xì)胞成熟的效率提供參考依據(jù)。
組織培養(yǎng)基(TCM-199)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、透明質(zhì)酸酶(Hy)、聚乙烯醇(Hepes-TL-PVA)、Triton X-100、anti-tubulin、Hoechst 33342均購自Sigma公司。立體顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司;共聚焦顯微鏡購自尼康公司;熒光定量PCR儀購自安捷倫公司;培養(yǎng)箱購自ESCO公司。
1.2.1 卵母細(xì)胞的收集和培養(yǎng)
從屠宰場收集豬卵巢放入到添加有75 ng/L青霉素G和50 ng/L硫酸鏈霉素的磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)中運(yùn)輸?shù)綄嶒炇摇S门鋫溆?8號針頭的10 mL注射器反復(fù)抽取卵巢上的2~8 mm卵泡,將卵泡液放入15 mL離心管中,在37 ℃水浴中靜置15 min后棄去上清液,加入Hepes-TL-PVA清洗液重懸沉淀,再次靜置15 min后棄去上清液,反復(fù)2次。將重懸液放入直徑為90 mm培養(yǎng)皿中,在顯微鏡下,用口吸管挑選卵丘包裹3層以上且細(xì)胞質(zhì)均勻的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes,COCs)。挑選完成后用培養(yǎng)液洗滌3遍,轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中平衡4 h左右的成熟培養(yǎng)液滴內(nèi)(25枚/100 μL),放入培養(yǎng)箱里(39 ℃,5% CO2),用礦物油覆蓋。
1.2.2 不同濃度chir-124處理卵母細(xì)胞
將chir-124溶于二甲基亞砜(DMSO)中保存,使用時用TCM199培養(yǎng)液稀釋。將GV期卵母細(xì)胞分別放入含有0、0.1、0.5和1 μmol/L的chir-124 TCM199培養(yǎng)基中,覆蓋石蠟油后在39 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在15 h時收集卵母細(xì)胞,進(jìn)行免疫熒光染色(使用Hoechst 33342對卵母細(xì)胞進(jìn)行活染,觀察其細(xì)胞核),并統(tǒng)計卵母細(xì)胞處于各時期(GV-Ⅰ,GV-Ⅱ,GV-Ⅲ,GV-Ⅳ 4個時期)的數(shù)量。隨后在18 h時收集卵母細(xì)胞,觀察并統(tǒng)計到達(dá)GVBD的卵母細(xì)胞。
1.2.3 0.5 μmol/L chir-124處理卵母細(xì)胞
使用0.5 μmol/L chir-124在卵母細(xì)胞成熟的不同時期進(jìn)行處理,處理時間分別為0~24 h、0~44 h、24~44 h(分別對應(yīng)GV期到GVBD期、GV期到MII期、GVBD期到MII期),隨后統(tǒng)計各階段卵母細(xì)胞的比率。
1.2.4 減數(shù)分裂相關(guān)基因的檢測
應(yīng)用實時熒光定量PCR進(jìn)行檢測。分別在0和0.5 μmol/L chir-124處理組各取20個GVBD期卵母細(xì)胞放入不含Ca2+和Mg2+的PBS中清洗,于液氮中迅速冷凍,-80 ℃保存?zhèn)溆谩J褂肈ynabeads mRNA Kit提取mRNA,利用Oligo(dT)12-18引物和SuperScript逆轉(zhuǎn)錄酶對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。用特異性引物(見表1)對chk1、cdk1、cdc25C、cyclinb1、gwl的mRNA進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。根據(jù)DyNSmo SYBR Green qPCR Kit方法進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s,退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán)。熔解曲線分析:65~95 ℃,加熱速率0.2 ℃/s,連續(xù)熒光測量,在實時熒光定量PCR反應(yīng)中加入SYBR Green,得到最終冷卻到12 ℃的熒光數(shù)據(jù)。通過生成熔解曲線對實時熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。應(yīng)用2-ΔΔCt法分析基因表達(dá)的相對定量。
表1 引物序列
1.2.5 免疫熒光染色
將卵母細(xì)胞經(jīng)0.1% PVA-PBS洗滌3次后,放入添有3.7%多聚甲醛的PVA-PBS中,在室溫下固定20 min,然后轉(zhuǎn)移到含0.5%的Triton X-100的PVA-PBS中透膜1 h;室溫下用PBS(含1% BSA)清洗5~8次,每次3 min,放入 PBS(含1% BSA)中在室溫下封閉1 h,之后在一抗中避光、4 ℃孵育過夜,抗體的稀釋比例是anti-tubulin(1∶200),anti-chk1(1∶200);第二天用PBS(含0.1% Tween 20 和 0.01% Triton X-100)室溫洗脫一抗6次,每次3 min,然后用二抗稀釋液在室溫下孵育1 h,稀釋液用PBS(1∶100 Alexa Fluor 488 goat-anti-mouse IgG);PBS(含0.1% Tween 20 和 0.01% Triton X-100)清洗6次,用Hoechst 33342 復(fù)染核;最后將卵母細(xì)胞放到玻璃載玻片上封片,在共聚焦顯微鏡下拍照。使用Image J軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。
每個試驗設(shè)有3次重復(fù),試驗數(shù)據(jù)均使用SAS程序進(jìn)行差異顯著性分析,所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
Chk1在豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂4個階段的表達(dá)與定位分別見圖1與圖2。結(jié)果表明,chk1 mRNA在GV期向GVBD期過渡階段的表達(dá)水平下降,在GVBD期到MI期階段的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),并且持續(xù)到MII期(圖1)。同時,Chk1蛋白在GV期主要定位在生發(fā)泡內(nèi),在 GVBD期主要定位在核的周圍,在MI期和MII期主要定位在紡錘體上(圖2)。
注:不同字母表示差異顯著(P<0.05);相同字母或無字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。下同圖1 chk1 mRNA在豬卵母細(xì)胞成熟過程中各個時期的表達(dá)水平
GV期卵母細(xì)胞的四個階段如圖3所示,用不同濃度(0、0.1、0.5及1 μmol/L)的chir-124對GV期的豬卵母細(xì)胞進(jìn)行處理后,觀察卵母細(xì)胞處于各個時期的比例如圖4和圖5所示。用0.5μmol/L的chir-124處理的卵母細(xì)胞在GV期前3個階段的影響與其他3組無顯著差異;但是在GV-IV階段其影響顯著高于其他3組(P<0.05)。而且0.5μmol/L chir-124處理的卵母細(xì)胞到達(dá)GVBD期的百分率顯著高于其他3組(P<0.05)。
DAPI.細(xì)胞核(藍(lán)色熒光);Chk1.Chk1蛋白(紅色熒光);Merged.合成圖圖2 Chk1蛋白在豬卵母細(xì)胞成熟過程中各個時期的定位(40×)
圖3 豬卵母細(xì)胞GV期的4個階段(40×)
圖4 不同濃度chir-124對GV期豬卵母細(xì)胞比率的影響
圖5 chir-124對豬卵母細(xì)胞GV期達(dá)到GVBD期比率的影響
為了進(jìn)一步研究Chk1在豬卵母細(xì)胞成熟過程中的作用,用0.5 μmol/L chir-124在卵母細(xì)胞成熟的不同時期進(jìn)行處理,結(jié)果見圖6。從GV期開始處理卵母細(xì)胞后,發(fā)育到GVBD期(圖6A)和MII期(圖6B)的比率均顯著高于對照組(P<0.05)。然而,從GVBD期開始處理卵母細(xì)胞,到達(dá)MII期的比率與對照組相比差異不顯著(圖6C)。
A.0~24 h;B.0~44 h;C.24~44 h圖6 chir-124處理不同時期豬卵母細(xì)胞的GVBD與MII百分率
如圖7所示,與對照組相比,0.5 μmol/L chir-124處理chk1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),同時gwlmRNA表達(dá)水平也顯著降低(P<0.05),cdc25C、cdk1和cyclinb1 mRNA表達(dá)水平的與對照組相比,有增加但無顯著差異。
圖7 chir-124處理對減數(shù)分裂相關(guān)基因表達(dá)的影響
如圖8所示,通過共聚焦顯微鏡觀察紡錘體的變化,與試驗組相比,對照組MI期染色體沒有完全分離;試驗組MI期、MII期紡錘體發(fā)生了很大變化,而對照組兩個時期的紡錘體幾乎沒有變化。
DAPI.細(xì)胞核(藍(lán)色熒光);Tubulin.紡錘體(綠色熒光);Merged.合成圖圖8 豬卵母細(xì)胞MI期和MII期的紡錘體形態(tài)(大圖10×;小圖40×)
Chk1被報道在卵母細(xì)胞成熟的每個階段都有表達(dá)[5-6]。為此,本研究在豬卵母細(xì)胞成熟的4個階段(GV、GVBD、MI和MII期)分別檢測了Chk1的表達(dá)與定位。結(jié)果顯示,Chk1從GV期到MII期的各個時期都有表達(dá),在MI期和MII期含量急劇升高,這表明細(xì)胞周期在這兩個階段容易受到干擾。此外,研究還發(fā)現(xiàn)Chk1隨著紡錘體的形成而產(chǎn)生變化,也表明Chk1可能通過影響紡錘體功能進(jìn)而影響豬卵母細(xì)胞的成熟。
卵母細(xì)胞GV期可以根據(jù)待成熟時受抑制狀態(tài)的生發(fā)泡的發(fā)育程度進(jìn)一步分為GV-Ⅰ、GV-Ⅱ、GV-Ⅲ和GV-Ⅳ 4個階段[15]。根據(jù)Tao等[16]的研究,本研究用不同濃度的chir-124對GV期的豬卵母細(xì)胞進(jìn)行處理,然后將卵母細(xì)胞分別定位于GV期的不同階段。結(jié)果顯示,所有處理組處于GV-Ⅰ期的卵母細(xì)胞比率均比對照組低,說明Chk1的消耗加快了卵母細(xì)胞從GV-Ⅰ期發(fā)育到GV-Ⅳ期的速度,且用0.5μmol/L的chir-124處理時卵母細(xì)胞達(dá)到GV-Ⅳ的比率顯著高于對照組。因此,在后續(xù)的試驗中都使用了這個濃度。
在小鼠中,降低Chk1的表達(dá)可以促進(jìn)卵母細(xì)胞到達(dá)GVBD的速率,但是對后續(xù)的減數(shù)分裂進(jìn)程沒有影響[5]。然而在豬卵母細(xì)胞中,Chk1的耗竭會降低卵母細(xì)胞成熟的速率,并對MI期卵母細(xì)胞的染色體排列產(chǎn)生不利影響[6]。本研究中,用0.5 μmol/L chir-124對GV期豬卵母細(xì)胞進(jìn)行處理后,發(fā)現(xiàn)Chk1的消耗顯著增加了豬卵母細(xì)胞達(dá)到GVBD的比率,并且相應(yīng)地增加了達(dá)到MII期的比率,但是在GVBD后再處理chir-124消耗Chk1時,這種促進(jìn)效果消失。因此,推測Chk1只是在GVBD前對豬卵母細(xì)胞的成熟有影響,即加快卵母細(xì)胞到達(dá)GVBD 的速率,但對隨后的成熟沒有影響。這與Nie等[6]的結(jié)果相反,可能是由于處理方法不同,對Chk1相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生了不同的影響,具體機(jī)制仍有待探究。
DNA損傷檢查點(diǎn)由ATM、ATR、Chk1或Chk2、Cdc25和其他相關(guān)的下游蛋白組成,通過信號通路ATM/ATR-Chk1/Chk2-Cdc25對細(xì)胞生長具有廣泛的作用[17-18]。其中Cdc25的磷酸化會導(dǎo)致CDK1的失活,而細(xì)胞減數(shù)分裂的開始與CDK1的活性密切相關(guān)[19]。本研究檢測了MII期卵母細(xì)胞中與CDK1相關(guān)基因的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)Chk1的消耗顯著降低了gwl基因的表達(dá),并且略微提升了cdc25C和cyclinb1基因的表達(dá)水平。其中,gwl基因負(fù)反饋調(diào)節(jié)cdk1基因,cdc25C和cyclinb1正反饋調(diào)節(jié)cdk1基因的去磷酸化,使其保持相對較高的活性水平[20-22],進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的進(jìn)程。
Chk1對于SAC的功能和將BubR1募集到動粒中是必需的[23]。在小鼠卵母細(xì)胞中,Chk1的消耗對于SAC的功能沒有影響,但是Chk1的過表達(dá)激活了SAC并阻止同源染色體的分離[5]。在豬卵母細(xì)胞中,Chk1的消耗減少了SAC相關(guān)蛋白的表達(dá)量[6]。本研究發(fā)現(xiàn),對照組MI期和MII期卵母細(xì)胞的染色體數(shù)量與狀態(tài)一致,即卵母細(xì)胞沒有渡過MI期,停滯在MI期;而chir-124處理組的卵母細(xì)胞,MII期的染色體數(shù)量相較于MI期明顯減半,說明Chk1的表達(dá)會活化SAC,從而阻止同源染色體的分離,將卵母細(xì)胞固定在MI期。
在豬卵母細(xì)胞體外成熟的GV期添加0.5 μmol/L chir-124來抑制Chk1的活性,可以促進(jìn)豬卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂,并促進(jìn)后續(xù)的成熟。