混合溶液中茶多酚、植酸含量的分光光度法測定及干擾消除

張 璇 李秋瑩 鐘克利 孫 彤* 楊麗麗 韓 英 勵建榮

（1 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 2 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點實驗室 遼寧錦州121013 3 渤海大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 遼寧錦州121013）

我國的水產(chǎn)品產(chǎn)量大、種類多，水產(chǎn)品總產(chǎn)量已連續(xù)20 多年位居世界首位[1]。然而，水產(chǎn)品易在物理、化學(xué)、微生物等方面發(fā)生變化，在貯運、加工和銷售過程中變色、變味，使食品失去鮮度甚至腐敗變質(zhì)[2]。水產(chǎn)品保鮮具有十分重要的現(xiàn)實意義[3]。目前，水產(chǎn)品保鮮方式可分為2 類：一是采用氣調(diào)[4]、低溫[5]、輻照[6]、超高壓[7]等方式，因其投資大，成本高，需要設(shè)備多，而不適合小批量產(chǎn)品；二是采用保鮮劑處理，該方法作為食品貯藏加工的有效輔助手段，發(fā)揮著十分重要的作用[8]。其中對于水產(chǎn)品保鮮更趨于采用不同來源的保鮮劑綜合運用的方法，以利于發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)，這樣不僅可以增強其抑菌性能，還可以提高其應(yīng)用的安全性[9]。

茶多酚（Tea polyphenols，TP）是茶葉中所含的一類多羥基酚類化合物的總稱，有良好的抗氧化和抑菌性能，能有效抑制微生物生長，延緩脂肪氧化，延長水產(chǎn)品的貨架期[10]。茶多酚中最重要成分是黃烷醇類的多種兒茶素（catechins），占總酚含量的60%～80%，它是抗氧化的主要成分[11]。植酸（Phytic acid，又稱肌醇六磷酸）可作為抗氧化劑、保鮮劑、水的軟化劑、金屬防腐蝕劑等，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及高分子工業(yè)等行業(yè)領(lǐng)域。植酸可降低水產(chǎn)品的pH 值，絡(luò)合金屬離子，抑制氧化和褐變，從而起到保鮮的作用，且對革蘭氏陰性菌有顯著的抑制作用[12]。茶多酚與植酸均為食品保鮮劑，復(fù)合使用有助于發(fā)揮其協(xié)同作用。

研究茶多酚和植酸的協(xié)同保鮮性能時，混合物質(zhì)中2 種組分含量的準確測定是工作開展的前提。目前，對混合溶液濃度同時測定的方法主要為液相色譜法[13]，然而，該方法對儀器的要求較高。茶多酚和植酸均可采用顯色后分光光度法測定，且混合物的雙波長分光光度法應(yīng)用較為廣泛[14]。研究表明，植酸對混合溶液中茶多酚濃度測定的結(jié)果無影響，而茶多酚含量可影響植酸顯色后的摩爾吸光系數(shù)，進而嚴重影響其測定結(jié)果的準確度。尋找一種簡單、準確，可同時測定混合溶液中茶多酚、植酸濃度的方法十分必要。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

茶多酚（食品級），安徽紅星藥業(yè)有限公司；植酸、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、磺基水楊酸等均為分析純級；去離子水自制。

MS 105DU 電子分析天平，梅特勒托利多儀器有限公司（瑞士）；Victor X3 酶標儀，美國珀金埃爾默公司（Perkin Elmer）。

1.2 試驗方法

顯色法測定茶多酚濃度：參照GB/T 8313-2002，茶、茶多酚測定[15]。酒石酸亞鐵溶液配制：稱取0.1000 g 硫酸亞鐵和0.5000 g 酒石酸鉀鈉，加水溶解并定容100 mL。分別準確吸取質(zhì)量濃度為0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mg/mL的茶多酚溶液200 μL 置于24 孔板中，加入1.000 mL 酒石酸亞鐵溶液，1.500 mL pH 7.5 磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol/L），用酶標儀測定波長490 nm 處溶液的吸光度，并繪制標準曲線。

顯色法測定植酸濃度：參照GB/T 5009.153-2016，食品中植酸的測定[16]。三氯化鐵-磺基水楊酸溶液配制：稱取1.5000 g 三氯化鐵和15.0000 g磺基水楊酸，加水溶解并定容500 mL，使用前用水稀釋15 倍。分別準確吸取質(zhì)量濃度為0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL 的植酸溶液100 μL 于24 孔板中，再加入2.000 mL 三氯化鐵-磺基水楊酸反應(yīng)溶液，用酶標儀測定波長490 nm 處溶液的吸光度，并繪制標準曲線。

同樣方法測定茶多酚和植酸待測液的吸光度，計算各組分質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚、植酸混合溶液中茶多酚質(zhì)量濃度的測定

茶多酚類物質(zhì)能與Fe2+定量形成紫藍色絡(luò)合物，可以用酒石酸亞鐵顯色，采用分光光度法測定其含量[15]。用酒石酸亞鐵顯色法處理梯度質(zhì)量濃度的茶多酚溶液、植酸溶液和含有定量植酸的茶多酚溶液后，測定其標準曲線，如圖1所示。由圖可見，梯度質(zhì)量濃度植酸溶液的吸光度均接近于0，即植酸在酒石酸亞鐵溶液中不顯色，未與Fe2+定量形成紫藍色絡(luò)合物（圖1a）。而茶多酚質(zhì)量濃度與溶液吸光度成正比，即與Fe2+定量形成了紫藍色絡(luò)合物（圖1b）。當茶多酚標準溶液中均含有0.5 mg/mL 植酸時，其標準曲線并未出現(xiàn)偏離（圖1b，1c），說明混合溶液中的植酸未干擾茶多酚顯色，即植酸不干擾酒石酸亞鐵顯色法測定茶多酚質(zhì)量濃度。茶多酚主要成份是表兒茶素和表沒食子兒茶素類，兒茶素結(jié)構(gòu)中羥基在苯環(huán)上的位置不同，既有鄰苯二羥基，又有連苯三羥基，還有沒食子酸形成的酯類衍生物。酒石酸亞鐵主要與茶多酚中的鄰位二羥基和連三羥基反應(yīng)而顯色，而對間位羥基和單羥基不顯色[17]。而植酸結(jié)構(gòu)中沒有鄰位二羥基，故植酸不能與酒石酸亞鐵定量顯色，進而不會干擾茶多酚質(zhì)量濃度的測定。

圖1 酒石酸亞鐵顯色法測定茶多酚、植酸及其混合溶液的標準曲線Fig.1 Standard curve of tea polyphenols，phytic acid and their mixed solution by ferrous tartrate coloration method

2.2 茶多酚、植酸混合溶液中植酸質(zhì)量濃度的測定

采用三氯化鐵-磺基水楊酸顯色法處理植酸標準溶液和含有一定質(zhì)量濃度茶多酚的植酸標準溶液，并測定其吸光度，繪制標準曲線，如圖2所示。當溶液中不含茶多酚時，植酸與三氯化鐵-磺基水楊酸混合液中Fe3+反應(yīng)，使混合溶液產(chǎn)生褪色反應(yīng)，植酸含量即與褪色程度成正比。而加入茶多酚后，植酸的標準曲線發(fā)生了偏移，溶液的吸光度降低，說明茶多酚也與Fe3+作用，產(chǎn)生了褪色反應(yīng)，進而干擾植酸質(zhì)量濃度的測定。由圖2可見，溶液中茶多酚質(zhì)量濃度較低時，植酸的褪色能力較強，隨著茶多酚質(zhì)量濃度增加，植酸標準曲線的斜率（絕對值）減小，說明茶多酚質(zhì)量濃度增加使植酸的褪色能力減弱。此外，當植酸質(zhì)量濃度較小時，茶多酚使溶液吸光度下降程度較大，而植酸質(zhì)量濃度較大時，同樣數(shù)量的茶多酚使溶液吸光度降低程度較小，說明較多的植酸使茶多酚的褪色能力減弱。分析認為，在三氯化鐵-磺基水楊酸顯色體系內(nèi)，磺基水楊酸的酚羥基與Fe3+在波長490 nm 附近形成了具有較大摩爾吸光系數(shù)的配合物。當將此顯色劑加入植酸溶液中時，植酸中的磷酸根與Fe3+形成配位鍵，使磺基水楊酸與Fe3+形成的部分配合物解離，溶液的吸光度降低。同理，將此顯色劑加入茶多酚溶液中時，茶多酚中的酚羥基與Fe3+形成配位鍵，使磺基水楊酸與Fe3+形成的部分配合物解離，溶液的吸光度降低。而當溶液中同時存在茶多酚和植酸時，植酸中的磷酸根與茶多酚中的酚羥基形成氫鍵，使裸露的磷酸根和酚羥基減少，減弱了其與Fe3+形成配位鍵的能力，表現(xiàn)為溶液褪色能力降低。為消除茶多酚對植酸濃度測定的干擾，將上述標準曲線進行線性模擬，結(jié)果如表1所示。

圖2 不同質(zhì)量濃度茶多酚混合溶液中植酸的標準曲線Fig.2 Standard curve of phytic acid solution with different mass concentration of tea polyphenols

表1 不同濃度茶多酚混合溶液中的植酸標準曲線方程Table 1 The linear regression equation of phytic acid with different concentrations of tea polyphenols in mixed solutions

由表1可見，各標準曲線的相關(guān)系數(shù)均達0.99 以上，說明植酸濃度與溶液吸光度呈線性關(guān)系。而混合溶液中茶多酚的質(zhì)量濃度對植酸標準曲線方程的斜率和截距均有影響。以茶多酚質(zhì)量濃度為橫坐標，植酸標準曲線方程的k，b 為縱坐標繪圖（圖3），可見茶多酚質(zhì)量濃度與線性方程截距和斜率不存在線性關(guān)系。分別采用二次和三次多項式模擬該曲線，結(jié)果見表2。

研究結(jié)果表明，采用三次多項式模擬茶多酚質(zhì)量濃度與k 值的關(guān)系時，其相關(guān)系數(shù)大于0.99，說明可用方程k=1.0522c3-0.3044c2+0.0938c-0.3319 描述兩者之間的關(guān)系。同理，可用二次多項式b=-0.76c2-0.2165c+1.4612 或三次多項式b=-2.8348c3+0.5157c2-0.3539c+1.4623 描述茶多酚質(zhì)量濃度與b 值的關(guān)系。

2.3 回收試驗

準確配制已知質(zhì)量濃度的茶多酚和植酸混合溶液，采用酒石酸亞鐵顯色法測定混合溶液中茶多酚的質(zhì)量濃度c，將其帶入k=1.0522c3-0.3044c2+0.0938c-0.3319 和b=-0.76c2-0.2165c+1.4612中，計算k、b 值，得植酸標準曲線。采用三氯化鐵-磺基水楊酸顯色法測定混合溶液的吸光度，計算混合溶液中植酸的質(zhì)量濃度，計算其回收率，結(jié)果如表3所示。

圖3 茶多酚質(zhì)量濃度與混合溶液中植酸標準曲線的斜率（a）、截距（b）的關(guān)系Fig.3 The relationship between the concentration of tea polyphenols and the slope （a），intercept （b）of the phytic acid standard curve

表2 k、b 值的模擬方程Table 2 The simulation equations for k and b values

表3 混合溶液中茶多酚和植酸濃度測定結(jié)果Table 3 The measurement results of concentration of tea polyphenols and phytic acid in mixed solution

結(jié)果表明，采用酒石酸亞鐵顯色結(jié)合三氯化鐵-磺基水楊酸顯色法同時測定茶多酚和植酸混合溶液中的各組分含量，茶多酚的測定回收率為97.50%～102.50%，植酸的測定回收率為96.36%～102.24%，測定誤差不超過±4%，說明該方法準確度較高，可用于測定混合溶液中茶多酚和植酸的含量。

3 結(jié)論

本文采用分光光度法同時測定混合溶液中茶多酚和植酸的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，混合溶液中茶多酚的質(zhì)量濃度可采用酒石酸亞鐵顯色法測定，植酸對測定結(jié)果無干擾；混合溶液中植酸的質(zhì)量濃度可采用三氯化鐵-磺基水楊酸顯色法，而茶多酚對其顯色能力有影響?？刹捎脭?shù)學(xué)擬合法獲得在一定茶多酚質(zhì)量濃度時，混合溶液中植酸的標準曲線，進而測定混合溶液中植酸的質(zhì)量濃度。該方法檢測最佳范圍為茶多酚質(zhì)量濃度0～0.300 mg/mL，植酸質(zhì)量濃度0～3.000 mg/mL。采用該方法測定混合溶液中茶多酚和植酸的質(zhì)量濃度，回收率為96%～103%，測定誤差不超過±4%，準確度高，具有廣泛的應(yīng)用價值。