應(yīng)用Discovery Studio（TOPKAT）軟件預(yù)測(cè)糖抑制PhIP過(guò)程中新產(chǎn)物的毒理學(xué)性質(zhì)

韓中惠 王曉敏 張 燕 劉 冰 王 碩*

（1 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院 濟(jì)南250353 2 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300457 3 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院 天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300071）

雜環(huán)胺（Heterocyclic aromatic amines，HAAs）是富含蛋白質(zhì)的食物在熱加工過(guò)程中形成的具有多環(huán)芳香族結(jié)構(gòu)的致癌、致突變的一類化合物[1-2]。這些雜環(huán)胺具有增加罹患結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌和食道癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。鑒于雜環(huán)胺對(duì)健康的危害，研究者通過(guò)外源添加抑制劑以減少雜環(huán)胺的形成。目前研究表明，多酚類化合物[5]、維生素[6]、金屬陽(yáng)離子[7]和酰胺類化合物[8]等物質(zhì)都能顯著減少食品中雜環(huán)胺的含量。

研究人員發(fā)現(xiàn)，不同種類的糖可有效降低雜環(huán)胺中2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4，5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo [4，5-b]pyridine，PhIP）的形成[9-11]。本課題組前期研究揭示了糖抑制PhIP 形成的可能作用機(jī)制，糖（葡萄糖、果糖和乳糖等）可通過(guò)熱降解形成α-二羰基化合物（丙酮醛、乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮等），而α-二羰基化合物可分別與PhIP 的前體物發(fā)生相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)形成新的產(chǎn)物，或者直接與PhIP反應(yīng)形成新的產(chǎn)物，從而減少食品體系中PhIP 的含量[12]。從食品安全的角度考慮，這些新形成的產(chǎn)物是否安全，決定了PhIP 減控后食品的安全性，因此，針對(duì)新產(chǎn)物毒理學(xué)性質(zhì)的研究具有重要意義。然而，由于加工食品組分的復(fù)雜性，對(duì)大量制備新產(chǎn)物進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提出了巨大挑戰(zhàn)，因此借助計(jì)算機(jī)軟件模擬預(yù)測(cè)新產(chǎn)物的毒性，十分必要。

Discovery Studio 中的TOPKAT 模塊軟件可以通過(guò)對(duì)化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)參數(shù)的計(jì)算，預(yù)測(cè)小分子化合物的毒性。TOPKAT 模塊軟件目前主要用于藥物設(shè)計(jì)研發(fā)中復(fù)雜成分的毒性預(yù)測(cè)以及市售藥品中的微量成分的毒性預(yù)測(cè)。美國(guó)食品和藥物管理局（Food and drug administration，F(xiàn)DA）和加拿大藥品評(píng)審委員會(huì)均利用這類數(shù)據(jù)庫(kù)幫助判斷相關(guān)化合物的毒性[13]。與傳統(tǒng)的毒理學(xué)試驗(yàn)相比，采用TOPKAT 模塊軟件進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)具有分析速度快，成本低，不依賴試驗(yàn)條件等優(yōu)點(diǎn)。TOPKAT 模塊軟件預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率超過(guò)85%[14]。本研究采用Discovery Studio （TOPKAT） 軟件，對(duì)糖抑制PhIP 形成過(guò)程中產(chǎn)生的相關(guān)新產(chǎn)物進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)，為全面評(píng)價(jià)PhIP 減控后的食品安全提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及設(shè)備

ChemDraw 12.0 軟件，美國(guó)Cambridge Soft 公司；Discovery Studio 分析軟件，美國(guó)BIOVIA 公司；Precision T7810 工作站，美國(guó)Dell 公司。

1.2 毒性計(jì)算方法

用ChemDraw 12.0 軟件繪制相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)式，生成Discovery Studio（TOPKAT）軟件可以識(shí)別的格式（sdf 格式）；將化合物結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入Discovery Studio 軟件，生成分子二維（2D）結(jié)構(gòu)；選擇要分析的化合物結(jié)構(gòu)式，再選擇相關(guān)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)后進(jìn)行分析[15]。本研究選擇的毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)為致突變性（Ames test）、潛在發(fā)育毒性、大鼠口服半致死量（Median lethal dose，LD50）、大鼠吸入半致死濃度（Median lethal concentration，LC50）、大鼠長(zhǎng)期口服最低毒副反應(yīng)水平和大鼠皮膚致敏性。

1.3 預(yù)測(cè)結(jié)果的分析判定

致突變性（Ames test）、潛在發(fā)育毒性（DTP）和皮膚致敏性的預(yù)測(cè)結(jié)果為概率值，當(dāng)預(yù)測(cè)值為0.000～0.300 時(shí)，被預(yù)測(cè)的化合物具有毒性的概率低，且可能會(huì)在實(shí)際測(cè)定中產(chǎn)生陰性結(jié)果；當(dāng)預(yù)測(cè)值大于0.300 或小于0.700 時(shí)，被預(yù)測(cè)的化合物所具有的毒性不確定；當(dāng)預(yù)測(cè)值大于0.700 時(shí)，被預(yù)測(cè)的化合物具有毒性的概率高，且可能會(huì)在實(shí)際測(cè)定中產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果[16]。大鼠口服LD50毒性范圍的定義為：LD50>15 g/kg，無(wú)毒性；5 g/kg

2 結(jié)果與分析

2.1 糖抑制PhIP 形成過(guò)程中的新產(chǎn)物

食品體系中的糖抑制PhIP 的形成，可以通過(guò)糖形成的活性中間體α-二羰基化合物中的丙酮醛分別與形成PhIP 的前體物肌酐或PhIP 發(fā)生反應(yīng)，形成新化合物[12]。糖在抑制PhIP 形成的過(guò)程中還會(huì)形成其它的α-二羰基化合物，例如：乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮。由于α-二羰基化合物是一類具有類似化學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)，根據(jù)它們新產(chǎn)生化合物的反應(yīng)形成機(jī)理，乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮也可分別與肌酐（如圖1）或PhIP（如圖2）發(fā)生反應(yīng)生成相應(yīng)的新化合物。圖1中α-二羰基化合物的活性基團(tuán)羰基與肌酐的活性基團(tuán)亞甲基或與氨基分別通過(guò)羥醛縮合和羰胺縮合反應(yīng)形成相應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物。圖2是α-二羰基化合物的活性基團(tuán)羰基與PhIP 的活性基團(tuán)亞甲基發(fā)生羰胺縮合反應(yīng)形成相應(yīng)的產(chǎn)物。

圖1 乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮與肌酐反應(yīng)產(chǎn)物的形成Fig.1 Formation of the reaction products of glyoxal，diacetyl and 3-deoxyglucosone with creatinine

圖2 乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮與PhIP 反應(yīng)產(chǎn)物的形成Fig.2 Formation of the reaction products of glyoxal，diacetyl and 3-deoxyglucosone with PhIP

2.2 新產(chǎn)物的毒理性質(zhì)預(yù)測(cè)

采用Discovery Studio（TOPKAT）軟件分別對(duì)丙酮醛、乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮與肌酐或PhIP 反應(yīng)形成相應(yīng)新化合物的毒理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并與PhIP 的毒理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

表1顯示了PhIP 的相關(guān)毒性預(yù)測(cè)結(jié)果，PhIP致突變性的預(yù)測(cè)數(shù)值為1.000，說(shuō)明PhIP 具有較高的致突變性，與PhIP 的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)報(bào)道一致[18]，說(shuō)明對(duì)于該化合物的毒性預(yù)測(cè)準(zhǔn)確。PhIP 潛在發(fā)育毒性的預(yù)測(cè)數(shù)值為0.000，表明PhIP 不具有潛在發(fā)育毒性。大鼠口服PhIP 的LD50值為9.5 mg/kg，屬于毒性范圍。PhIP 對(duì)于大鼠吸入LC50和大鼠長(zhǎng)期口服最低毒副反應(yīng)水平最小量分別為859.1 mg/kg 和43.2 mg/kg。PhIP 使皮膚致敏性的結(jié)果為0.000，表明不具有使皮膚致敏的可能性。

表1 PhIP 的相關(guān)毒性Table 1 Related toxicity of PhIP

表2顯示了丙酮醛、乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮與肌酐由羥醛縮合和羰胺縮合反應(yīng)途徑形成相關(guān)產(chǎn)物的毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)據(jù)。從表中可以看出這8 種產(chǎn)物致突變性和潛在發(fā)育毒性的數(shù)值均為1.000，這表明它們致突變性和潛在發(fā)育毒性的結(jié)果均呈陽(yáng)性，這些產(chǎn)物致突變性的結(jié)果與PhIP 致突變性的結(jié)果相同，沒有發(fā)生變化，而它們的潛在發(fā)育毒性與PhIP 相比毒性增強(qiáng)。這8種產(chǎn)物的大鼠口服LD50值分別在輕度毒性、實(shí)際無(wú)毒性和無(wú)毒性的范圍，它們均比PhIP 的大鼠口服LD50量低，表明這些產(chǎn)物半致死量的毒性比PhIP 弱；其中3-脫氧葡萄醛酮和肌酐經(jīng)羥醛縮合反應(yīng)途徑形成產(chǎn)物的半致死量值最大為85.6 g/kg，表明該產(chǎn)物在大鼠口服LD50評(píng)價(jià)中表現(xiàn)的毒性最小。在大鼠吸入LC50的評(píng)價(jià)指標(biāo)中，這8 種產(chǎn)物的半致死濃度均比PhIP 的859.1 g/m3·H 低，表明8 種產(chǎn)物在這個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)中的毒性均比PhIP強(qiáng)。這些產(chǎn)物（除丙酮醛和肌酐經(jīng)羰胺縮合反應(yīng)途徑形成的產(chǎn)物外） 的大鼠長(zhǎng)期口服最低毒副反應(yīng)水平的量均比PhIP 小，表明除個(gè)別產(chǎn)物外，大部分產(chǎn)物的形成使它的毒性增強(qiáng)。在皮膚致敏性的評(píng)價(jià)指標(biāo)中，通過(guò)數(shù)據(jù)分析表明這些反應(yīng)產(chǎn)物不具有使皮膚致敏的可能性，與對(duì)PhIP 預(yù)測(cè)的結(jié)果相同，雖然3-脫氧葡萄醛酮和肌酐經(jīng)羥醛縮合途徑形成的產(chǎn)物使皮膚致敏性的預(yù)測(cè)結(jié)果為0.255，但是該值仍處在不具有致敏性的范圍內(nèi)。此外，在致突變性、潛在發(fā)育毒性、大鼠吸入LC50和大鼠皮膚致敏性這4 個(gè)毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)中，經(jīng)羥醛縮合和羰胺縮合途徑形成產(chǎn)物的毒性分別與PhIP 對(duì)比結(jié)果都一致，這表明在一定程度上這些產(chǎn)物之間的毒性性質(zhì)相似。

表2 反應(yīng)產(chǎn)物（肌酐與α-二羰基化合物）的相關(guān)毒性Table 2 Related toxicity of reaction product （creatinine and α-dicarbonyl compounds）

α-二羰基化合物（丙酮醛、乙二醛、丁二酮和3-脫氧葡萄醛酮）與PhIP 的4 種反應(yīng)產(chǎn)物的相關(guān)預(yù)測(cè)毒性結(jié)果見表3，結(jié)果顯示α-二羰基化合物與PhIP 反應(yīng)產(chǎn)物致突變性的結(jié)果為陽(yáng)性，這與預(yù)測(cè)PhIP 致突變性的結(jié)果相同，表明致突變的毒性沒有發(fā)生變化。對(duì)這4 種反應(yīng)產(chǎn)物的潛在發(fā)育毒性和皮膚致敏性預(yù)測(cè)的結(jié)果均為陰性，這與PhIP的結(jié)果相同，表明潛在發(fā)育和皮膚致敏的毒性也沒有發(fā)生變化。這4 種產(chǎn)物的大鼠口服LD50（mg/kg）量分別為16.2，20.0，16.4，275.9 mg/kg，此結(jié)果明顯高于PhIP（9.5 mg/kg）的LD50量，說(shuō)明相比PhIP 來(lái)說(shuō)，這4 種產(chǎn)物的毒性降低，然而還在毒性或中度毒性范圍內(nèi)，其中PhIP 與3-脫氧葡萄糖醛酮的產(chǎn)物毒性最小。在大鼠吸入LC50方面，這些產(chǎn)物（除PhIP 與乙二醛反應(yīng)產(chǎn)物）表現(xiàn)出的毒性均比PhIP 低。然而，這4 種產(chǎn)物的大鼠長(zhǎng)期口服最低毒副反應(yīng)水平量均高于PhIP，說(shuō)明在大鼠長(zhǎng)期口服最低毒副反應(yīng)水平上表現(xiàn)出毒性降低現(xiàn)象。

表3 反應(yīng)產(chǎn)物（PhIP 與α-二羰基化合物）的相關(guān)毒性Table 3 Related toxicity of reaction product （PhIP and α-dicarbonyl compounds）

3 討論

通過(guò)TOPKAT 軟件預(yù)測(cè)分析表明，在致突變性（Ames test）評(píng)價(jià)中，α-二羰基化合物與肌酐的反應(yīng)產(chǎn)物和α-二羰基化合物與PhIP 的反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果相同，均具有致突變毒性，與PhIP 所具有的毒性相比沒有發(fā)生變化；在潛在發(fā)育毒性評(píng)價(jià)中，α-二羰基化合物與肌酐的反應(yīng)產(chǎn)物所具有的毒性與PhIP 相比增強(qiáng)，而α-二羰基化合物與PhIP 的反應(yīng)產(chǎn)物與PhIP 的結(jié)果相同，毒性沒有發(fā)生改變；在大鼠口服LD50和大鼠長(zhǎng)期口服最低毒副反應(yīng)水平評(píng)價(jià)中，絕大部分α-二羰基化合物與肌酐反應(yīng)產(chǎn)物的毒性均比PhIP 強(qiáng)，而α-二羰基化合物與PhIP 的反應(yīng)產(chǎn)物所表現(xiàn)的毒性比PhIP 弱；在大鼠吸入LC50評(píng)價(jià)中，大部分產(chǎn)物的毒性均比PhIP 的毒性強(qiáng)；在皮膚致敏性評(píng)價(jià)指標(biāo)中，α-二羰基化合物與肌酐的反應(yīng)產(chǎn)物和α-二羰基化合物與PhIP 的反應(yīng)產(chǎn)物均不具有皮膚致敏毒性。從這3 種反應(yīng)途徑形成的產(chǎn)物來(lái)看，每個(gè)途徑形成產(chǎn)物之間的結(jié)果與PhIP 對(duì)比的結(jié)果整體一致，說(shuō)明在一定程度上這一類的化合物毒理學(xué)性質(zhì)相似。其毒理學(xué)性質(zhì)相似可能是α-二羰基化合物與于肌酐/PhIP 形成產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定的，不同途徑形成產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有較多的相同官能團(tuán)，所以使同一途徑形成的產(chǎn)物具有類似的活性。

綜合以上分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖抑制PhIP 產(chǎn)生過(guò)程中的新化合物仍存在不同程度的毒性。盡管糖可以抑制雜環(huán)胺PhIP 的產(chǎn)生，減少雜環(huán)胺本身的危害，然而由于伴隨產(chǎn)物的危害仍存在，并不能完全保障整體食品的安全性。對(duì)糖抑制雜環(huán)胺PhIP產(chǎn)生過(guò)程中新產(chǎn)物的毒性研究結(jié)果僅為其毒理學(xué)特性評(píng)價(jià)提供依據(jù)，要準(zhǔn)確評(píng)價(jià)新產(chǎn)物的毒理性質(zhì)，仍需全面系統(tǒng)的進(jìn)行毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估。