靶向細(xì)菌細(xì)胞壁新型食品保鮮劑的虛擬篩選

高 雙 楊銀萍 宋佳旭 宮興文

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018）

微生物生長繁殖是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的重要原因，食品在原料處理、生產(chǎn)、包裝及運輸和銷售等過程中均有可能被微生物污染[1]。導(dǎo)致冷鮮肉腐敗變質(zhì)的微生物以細(xì)菌為主，包括需氧嗜冷的莫拉氏菌屬（Moraxella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和兼性厭氧的腸桿菌科（Enterobacteriaceae）等革蘭氏陰性菌，以及乳桿菌屬（Lactobacillus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）等革蘭氏陽性菌[2]。目前市場上的保鮮劑種類繁多，有合成的、天然的，大多數(shù)保鮮劑的作用機(jī)理并不明確。溶菌酶、殼聚糖、茶多酚以及Nisin 等是目前研究較多的幾種保鮮劑，而這些保鮮劑局限性明顯，其中大部分保鮮劑是針對革蘭氏陽性菌，而對大腸桿菌（Escherichia coli）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）等革蘭氏陰性菌的抑菌效果較差或根本沒有效果，并且部分保鮮劑（如有機(jī)酸等）作用于細(xì)胞膜，可能給同樣具有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的人體帶來傷害[1]。

細(xì)胞壁是微生物和植物細(xì)胞的特有結(jié)構(gòu)，對維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和體內(nèi)外滲透壓平衡起重要作用，而人和其它動物的細(xì)胞均沒有細(xì)胞壁，若以細(xì)菌細(xì)胞壁為保鮮劑的作用靶點，原則上對人體細(xì)胞無害或者毒害較小[2]。細(xì)菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分為肽聚糖（又稱粘肽、胞壁質(zhì)），在肽聚糖的生物合成過程中，粘肽合成酶 （Penicillin-binding proteins，PBPs）起著至關(guān)重要的作用，該酶具有很高的轉(zhuǎn)肽酶和羧肽酶活性，對細(xì)菌的生長與繁殖均有重要作用[3-5]。若能找到合適的先導(dǎo)化合物，使其與細(xì)菌的粘肽合成酶結(jié)合，抑制該酶的活性，則可使細(xì)菌細(xì)胞壁缺損，菌體膨脹裂解而死亡，β-內(nèi)酰胺類抗生素（如青霉素類和頭孢菌素類）就是通過此機(jī)理來發(fā)揮殺菌作用[6-7]。

本研究采用分子對接軟件DOCK6.5 進(jìn)行虛擬篩選，針對革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌和大腸桿菌的多個粘肽合成酶進(jìn)行多靶點的大規(guī)模篩選，以期篩選出對革蘭氏陰性菌具有較好抗菌活性的先導(dǎo)化合物。此外，以冷鮮肉為原料，以山梨酸鉀為陽性對照，測定先導(dǎo)化合物的保鮮效果。

1 材料和方法

1.1 軟件及數(shù)據(jù)庫

DOCK6.5 程序為免費軟件，由美國加州大學(xué)Kuntz 等開發(fā)。

本研究所用的小分子化合物結(jié)構(gòu)來自于ZINC 數(shù)據(jù)庫的drug-like 子集，數(shù)量約580 萬個。

1.2 材料及試劑

山梨酸鉀、氯化鈉、氧化鎂，天津永大化學(xué)試劑有限公司；硼酸，阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸、乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司。

1.3 儀器及設(shè)備

KDN-103F 凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；AL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；pH 計（DELTA320），特勒托利多儀器有限公司；CR-400/410 色差計，柯尼卡美能達(dá)；BIO-05拍打器，上海般諾生物科技有限公司；玻璃培養(yǎng)皿（直徑90 mm），杭州匯普化工試劑有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；LDEX-5OKB 立式蒸汽壓力滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SHP-250 智能生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；101-5 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司；JJ-CJ-IFD 超凈工作臺，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；Haler BCD-278B 冰箱，青島海爾電冰箱有限公司。

1.4 虛擬篩選

采用DOCK6.5 進(jìn)行分子對接，以銅綠假單胞菌的粘肽合成酶PBP3 和大腸桿菌的粘肽合成酶PBP1b，PBP4 和PBP5 作為虛擬篩選的靶點。首先，以PBP3 為起始，將ZINC 數(shù)據(jù)庫中的小分子化合物依次對接入受體蛋白的活性中心，通過基于Grid score 的能量計算，篩選出能量低于-125.58 kJ/mol 的化合物結(jié)構(gòu)，用于下一個靶點的對接。依次對各個靶點進(jìn)行對接，篩選出對各個靶點均具有較好Grid score 打分的化合物結(jié)構(gòu)，按照上述順序進(jìn)行第2 輪基于Amber score 的篩選，篩選出對各個靶點均具有較好Amber score 打分的化合物結(jié)構(gòu)。之后，根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)及在各個靶點的打分情況，挑選出親和力高且結(jié)構(gòu)新穎的先導(dǎo)化合物。

1.5 先導(dǎo)化合物的合成[1，9]

在100 mL 二氯甲烷中加入三聚氯氰5.0 g 攪拌溶解，另取50 mL 二氯甲烷，加入5.2 mL N-N二異丙基乙胺和2.68 mL 哌啶，將上述溶有三聚氯氰的二氯甲烷逐滴加入，并維持反應(yīng)溫度在0℃，反應(yīng)2 h 后分別用2×100 mL 濃鹽酸和100 mL水進(jìn)行水洗，靜置分層，取二氯甲烷層，旋蒸除去二氯甲烷，烘干，得到淡黃色固體粉末。

我們發(fā)現(xiàn)：不是學(xué)生天生不愛讀書，而是他們無書可讀，無感興趣的書。根據(jù)這一情況，我們在班級層面，組建“班級讀書互助會”，解決書籍的來源問題。蘇霍姆林斯基在他的《課堂教學(xué)與課外閱讀》一文中曾提到“書籍合作社”一詞。我們發(fā)現(xiàn)“書籍合作社”與我們創(chuàng)設(shè)的“班級讀書互助會”有異曲同工之處。它們都是為了解決學(xué)生無書可讀的問題，都是為了解決書籍的來源問題。

取上述步驟中合成的產(chǎn)物4.66 g 溶解于丙酮，另取6.6 g 氫氧化鈉和3.45 g 甘氨酸溶解于50 mL 水中，于1 h 內(nèi)逐滴加入到上述丙酮溶液中，70 ℃反應(yīng)4 h 后冷卻，在室溫繼續(xù)攪拌1 h，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2，冰浴20 min，使固體析出后，過濾，用10 mL 蒸餾水洗3 次，再用10 mL丙酮洗2 次，70 ℃烘干，得到白色固體粉末[1，9]。

1.6 先導(dǎo)化合物的保鮮效果

1.6.1 樣品預(yù)處理[1]取冷鮮肉，無菌操作，切成50 g 左右的肉塊，分為3 組?？瞻讓φ战M以無菌水處理，陽性對照組用1 mg/mL 山梨酸鉀處理，試驗組以1 mg/mL 先導(dǎo)化合物處理。將肉塊在不同處理液中浸泡2 min，然后瀝干10 min，用滅過菌的保鮮膜緊密包裹，盡量除去空氣，置于冰箱冷藏室保存。之后，每3 d 取樣測定1 次[1]。

1.6.2 冷鮮肉pH 值的變化 參照GB/T 9695.5-2008《肉與肉制品pH 測定》的方法測定。評定標(biāo)準(zhǔn)為：pH 值不超過6.2 為新鮮肉，pH 值在6.3～6.6為次鮮肉，而pH 值超過6.7 為變質(zhì)肉[1，10]。

1.6.3 冷鮮肉菌落總數(shù)的變化 參照GB 4789.2-94《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》的方法測定。評定標(biāo)準(zhǔn)為：菌落總數(shù)小于1×104CFU/g為一級鮮肉，在1×104～1×106CFU/g 為二級鮮肉，而菌落總數(shù)超過1×106CFU/g 為變質(zhì)肉[1，11]。

1.6.4 冷鮮肉汁液流失率的變化 將保藏的冷鮮肉樣品放置于天平上，記錄其質(zhì)量為m1；取下保鮮膜，擦干肉及保鮮膜中所有液體后再次稱重，記為m2；稱量保鮮膜的質(zhì)量，記為m3。根據(jù)文獻(xiàn)中的公式計算冷鮮肉汁液流失率[1，12]，重復(fù)測定3 次，取平均值作為最后的結(jié)果。

1.6.5 冷鮮肉揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的變化 參照GB/T 5009.44-2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的半微量定氮法，測定冷鮮肉的揮發(fā)性鹽基氮含量[1，13]。

1.6.6 冷鮮肉色差的變化[1]使用色差計測定冷鮮肉的顏色變化，測定方法：將保藏的樣品切成1 cm×1 cm×1 cm 的肉塊，用色差計測定這些肉塊的L*值、a*值和b*值，重復(fù)測定3 次，取平均值作為最終結(jié)果。其中，L*值表示肉的亮度，a*值反映肉的紅度，二者與肉的新鮮度呈正相關(guān)，數(shù)值越大則越新鮮，b*值代表黃度，與肉的新鮮度呈負(fù)相關(guān)[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 配體與受體文件的制備

從protein data bank 網(wǎng)站下載銅綠假單胞菌粘肽合成酶PBP3、大腸桿菌粘肽合成酶PBP1b，PBP4，PBP5 與配體的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，按照DOCK6.5 手冊進(jìn)行配體和受體文件的制備，主要包括刪除多余亞基，去除溶劑，加氫，加電荷，修正錯誤命名的氨基酸殘基等處理，保存為相應(yīng)的文件。

2.2 生成球集

利用DOCK6.5 自帶的sphgen 程序產(chǎn)生球集，選擇距離配體結(jié)合位點5 ? 范圍內(nèi)的球集，去除其中位置不佳的的球集，作為分子對接時的結(jié)合位點，再生成一個距離球集10 ? 的盒子，用于限制先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)大小。

2.3 第1 輪篩選

利用Grid score 進(jìn)行能量打分，挑選與各個靶點的相互作用能均低于-125.58 kJ/mol 的化合物結(jié)構(gòu)，約6 萬個，用于下一輪的虛擬篩選。

2.4 第2 輪篩選

采用Amber score 進(jìn)行第2 輪能量打分，Amber score 的優(yōu)勢是距離配體特定距離的受體氨基酸殘基是柔性的，配體結(jié)構(gòu)也是柔性的，使得二者之間的相互作用更加符合誘導(dǎo)契合效應(yīng)，因而計算結(jié)果更加精確，然而計算量大，因而速度較慢。

經(jīng)第2 輪虛擬篩選，挑選出與各個靶點之間相互作用能均低于-87.72 kJ/mol 的化合物結(jié)構(gòu)，約有200 個。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)篩選出的大部分化合物結(jié)構(gòu)新穎，未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)的研究報道。同時，絕大多數(shù)化合物的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，較難合成，還有一些化合物的合成原料成本過高。因此，擬選取其中一種結(jié)構(gòu)較簡單的先導(dǎo)化合物進(jìn)行研究，該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 先導(dǎo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of lead compound

這個化合物的結(jié)構(gòu)較簡單，易于合成，而且其結(jié)構(gòu)上含有兩個甘氨酸基團(tuán)，安全性方面也有一定的保證。該化合物與銅綠假單胞菌粘肽合成酶PBP3、大腸桿菌粘肽合成酶PBP1b，PBP4 和PBP5的Grid score 分別為-249.43，-223.82，-210.34，-245.79 kJ/mol，而Amber score 分別為-131.56，-91.84，-137.30，-191.04 kJ/mol，從能量打分情況來看，與各個靶點均具有較高的親和力。

對先導(dǎo)化合物與各個靶點氨基酸殘基之間的相互作用情況進(jìn)行分析，它與大腸桿菌PBP1b 的相互作用最少，只有2 個氫鍵和1 個疏水作用，而與銅綠假單胞菌PBP3 和大腸桿菌PBP4 之間均為4 個氫鍵和2 個疏水作用，相互作用最多的為大腸桿菌PBP5，共有6 個 疏水作用（SER83，SER84，SER107，LEU150，THR211，GLY212） 和4個 氫鍵 （SER41，ASN109，ARG245），其中，與ARG245 的胍基可以形成2 個氫鍵（圖2）。這種相互作用數(shù)量的多少與Amber score 的能量打分規(guī)律完全吻合，即相互作用越多，能量越低，相互作用越少，能量越高。

圖2 先導(dǎo)化合物與大腸桿菌PBP5 的相互作用分析Fig.2 Interactions between lead compound and E.coli PBP5

2.5 先導(dǎo)化合物的合成

根據(jù)先導(dǎo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，首先進(jìn)行2，4-二氯-6-哌啶基-1，3，5-均三嗪的合成，之后再連接上2 個甘氨酸，具體合成路線如圖3所示。

合成產(chǎn)物經(jīng)純化后，用甲醇溶解，通過質(zhì)譜儀進(jìn)行分子質(zhì)量測定。如圖4所示，合成產(chǎn)物的分子質(zhì)量為311 u，與先導(dǎo)化合物的理論分子質(zhì)量一致。

2.6 先導(dǎo)化合物的食品保鮮效果研究

2.6.1 冷鮮肉pH 值的變化研究 以往研究表明，在冷鮮肉的保藏早期，pH 值通常會出現(xiàn)短時間的下降，這主要是因為肌肉中的糖元在無氧條件下發(fā)生了酵解，同時ATP 也被緩慢分解，產(chǎn)生了乳酸、磷酸等酸性物質(zhì)，而隨著貯存時間的延長，肌肉中的微生物以及蛋白酶開始分解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生多肽等含氮的堿性物質(zhì)，pH 值逐漸上升[1，14]，這與本研究的pH 值變化規(guī)律一致。

從圖5a可以看出，從第3 天開始，先導(dǎo)化合物組的pH 值一直顯著低于空白對照組，并在整體上略低于山梨酸鉀組，說明先導(dǎo)化合物可以減緩冷鮮肉蛋白質(zhì)的分解速度，并且效果好于山梨酸鉀，與空白對照組相比，大約可以延長3 d 保藏時間。

圖3 先導(dǎo)化合物的合成Fig.3 Synthesis of lead compound

圖4 先導(dǎo)化合物的質(zhì)譜分析Fig.4 Mass spectrum analysis of lead compound

圖5 冷鮮肉的pH 值（a）、菌落總數(shù)（b）、汁液流失率（c）及揮發(fā)性鹽基氮（d）的變化Fig.5 Changes in pH value （a），total bacterial colonies （b），drop loss （c） and TVB-N （d） of chilled pork

2.6.2 冷鮮肉菌落總數(shù)的變化研究 抑制微生物的生長繁殖是延長食品保藏時間的重要方法，微生物數(shù)量是判斷食品新鮮度的重要指標(biāo)。從圖5b可知，冷鮮肉的菌落總數(shù)在貯藏早期均有一個小幅度的下降過程，這與pH 值的變化情況一致，可能由于保藏早期肌糖元分解產(chǎn)生乳酸所致[14]。從第3 天開始，各組保藏樣品的菌落總數(shù)均呈上升趨勢，其中空白對照組的增長速度快，菌落數(shù)量顯著高于先導(dǎo)化合物組和山梨酸鉀組（P<0.05）。而先導(dǎo)化合物和山梨酸鉀處理組的菌落增長速度則比較緩慢，說明二者皆可抑制微生物的生長。同時，先導(dǎo)化合物處理組的菌落數(shù)一直低于山梨酸鉀組，說明先導(dǎo)化合物的抗菌活性要優(yōu)于山梨酸鉀。

2.6.3 冷鮮肉汁液流失率的變化研究 在冷鮮肉保藏期間，隨著微生物的生長繁殖，蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分逐漸被破壞，水分會伴隨營養(yǎng)成分流失從組織中滲透出來[1]。從圖5c可知，冷鮮肉的汁液流失率隨著貯藏時間延長呈上升趨勢，尤其是空白對照組，其汁液流失率顯著高于先導(dǎo)化合物和山梨酸鉀處理組（P<0.05），而先導(dǎo)化合物處理組的汁液流失情況比山梨酸鉀處理組稍好，然而差異不顯著（P>0.05）。

2.6.4 冷鮮肉揮發(fā)性鹽基氮的變化研究 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是在食品貯藏過程中因蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生的一系列堿性物質(zhì)，通常揮發(fā)性鹽基氮的含量越高，說明食品中營養(yǎng)成分的損失越多，食品的新鮮度越低[15]。從圖5d可以看出，貯藏樣品的揮發(fā)性鹽基氮值均隨時間延長呈上升趨勢，其中，空白對照組的TVB-N 值顯著高于先導(dǎo)化合物和山梨酸鉀處理組（P<0.05），說明先導(dǎo)化合物和山梨酸鉀均具有抑制蛋白質(zhì)分解，降低揮發(fā)性鹽基氮含量的作用。同時，先導(dǎo)化合物組的揮發(fā)性鹽基氮值略低于山梨酸鉀組，表明先導(dǎo)化合物的效果更好一些。

2.6.5 冷鮮肉顏色的變化研究 肉的顏色是衡量其新鮮度的一個重要指標(biāo)[16-17]，從圖6a可知，貯藏樣品的L*值均隨著時間延長呈下降趨勢，其中，空白對照組從第3 天開始L*值出現(xiàn)快速下降，顯著低于先導(dǎo)化合物和山梨酸鉀處理組 （P<0.05），先導(dǎo)化合物組的L*值下降速度比空白對照組慢，說明其對冷鮮肉具有一定的護(hù)色作用，而山梨酸鉀組的L*值下降速度最慢，護(hù)色效果最好。

各組樣品a*值的變化情況如圖6b所示，其中，空白對照組a*值從第3 天開始即大幅度下降，顯著低于先導(dǎo)化合物和山梨酸鉀處理組（P<0.05），而先導(dǎo)化合物和山梨酸鉀處理組的a*值從第6 天才開始下降，并且一直顯著高于空白對照組（P<0.05），說明二者對保持肉品顏色，延緩紅度值下降具有一定作用。另外，各組a*值的總體變化均呈先升后降的趨勢，這可能與肌紅蛋白的氧化有關(guān)，該蛋白與氧氣反應(yīng)后先變成亮紅色的氧合肌紅蛋白，然后繼續(xù)與氧氣反應(yīng)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成高鐵肌紅蛋白，紅度值降低，從而在整體上a*值呈先增加而后降低的趨勢[16-17]。

對各組樣品b*值的變化情況也進(jìn)行了研究，如圖6c所示，第3 天開始，各組樣品的b*值不斷增加，其中空白對照組的上升速度最快，b*值顯著高于先導(dǎo)化合物和山梨酸鉀處理組 （P<0.05），表明先導(dǎo)化合物和山梨酸鉀具有降低冷鮮肉黃度值的功效，并且先導(dǎo)化合物處理組的b*值最低，說明其效果最好。

圖6 4 ℃下冷鮮肉的顏色變化情況Fig.6 Color changes of chilled pork during the storage at 4 ℃

3 結(jié)論

細(xì)菌的粘肽合成酶是與細(xì)胞壁合成密切相關(guān)的重要蛋白酶，β-內(nèi)酰胺類抗生素（如青霉素類和頭孢菌素類）能夠結(jié)合這些酶的催化中心，抑制細(xì)菌的細(xì)胞壁合成，導(dǎo)致細(xì)胞壁缺損，細(xì)胞膨脹裂解而死亡。

在本研究中，選擇了革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌和大腸桿菌的多個粘肽合成酶作為虛擬篩選的靶點，以便獲得對革蘭氏陰性菌具有較好抗菌活性的先導(dǎo)化合物。由于先導(dǎo)化合物靶向細(xì)菌的粘肽合成酶，通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁合成而發(fā)揮抗菌作用，而人和其它動物的細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，因此理論上對人體細(xì)胞傷害較小。另外，以冷鮮肉為研究對象，研究了先導(dǎo)化合物的食品保鮮能力，通過測定冷鮮肉的pH 值、揮發(fā)性鹽基氮、汁液流失率、細(xì)菌菌落總數(shù)和肉的顏色等指標(biāo)，對先導(dǎo)化合物的保鮮效果進(jìn)行了評價。研究結(jié)果表明，先導(dǎo)化合物處理組的各項指標(biāo)均顯著優(yōu)于空白對照組（P<0.05），說明它對冷鮮肉具有非常好的保鮮效果。與常用的食品保鮮劑山梨酸鉀相比，先導(dǎo)化合物除了護(hù)色能力稍差以外，其它各項指標(biāo)均優(yōu)于山梨酸鉀。

綜上所述，通過虛擬篩選獲得了結(jié)構(gòu)新穎的先導(dǎo)化合物，該先導(dǎo)化合物可以減緩冷鮮肉的腐敗速度，延長保藏時間，展示出了在食品保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用前景。在后續(xù)的研究工作中，將選擇更多種類的食品來檢驗這種先導(dǎo)化合物的保鮮效果。此外，通過虛擬篩選，還獲得了許多結(jié)構(gòu)新穎的化合物，將從中挑選一些結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的化合物進(jìn)行合成，以便獲得保鮮效果更好的先導(dǎo)化合物。