高產(chǎn)胞外多糖舊金山乳桿菌的篩選及其在饅頭中的應用

張國華 張緯珍 王 淇 梁星星 高 潔

（1 山西大學生命科學學院 太原030006 2 河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院 河北保定071000）

胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌在生長代謝過程中產(chǎn)生并分泌到細胞壁外的一類水溶性糖類化合物[1]，按其所在位置的不同分為莢膜多糖[2-3]和黏液多糖[4]，按多糖的組成可分為同型多糖和異型多糖，其功能特性主要取決于EPS 組成、分子質量大小及結構[5-6]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌胞外多糖可以替代親水膠體[7]，起到改善面包體積、質構、營養(yǎng)價值及抗老化等方面的作用，因而受到越來越多的研究者關注。Tamani 等[8]研究發(fā)現(xiàn)酸面團來源的乳酸菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus LB18，L.delbrueckii subsp.bulgaricus CNRZ 737，L.delbrueckii subsp.bulgaricus 2483），在面團發(fā)酵過程中產(chǎn)生的EPS 可起到增加面包體積，抗面包老化的效果，而不產(chǎn)EPS 的酸面團來源的乳酸菌（Lactobacillus helveticus LH30） 對面包品質及老化并沒有作用，其原因可能是乳酸菌產(chǎn)生的EPS增強面包保水性，進而改善面包品質及老化特性。Xu 等[9]研究發(fā)現(xiàn)蔗糖的添加有助于提高明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides DSM 20193）的EPS 產(chǎn)量，而且EPS 含量多少直接影響蠶豆面團理化特性及流變特性。國內研究也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)EPS 的乳酸菌對饅頭感官品質、比容、硬度等有顯著改善。李志建等[10]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)EPS 的植物乳桿菌與酵母菌以100︰1 的比例添加到面團中，會顯著降低發(fā)酵面團的pH 值、還原糖含量及饅頭的硬度，并提高饅頭的白度等。楊曉露等[11]研究也發(fā)現(xiàn)添加了高產(chǎn)EPS 的植物乳桿菌L1 （L.plantarum L1）制備的饅頭比容明顯增大，白度略微增大，感官評分較高。

目前，雖然活性干酵母已作為單一菌種應用于面制品的發(fā)酵生產(chǎn)，但是與傳統(tǒng)發(fā)酵劑的混菌體系發(fā)酵相比，發(fā)酵的饅頭口感單一，風味略顯不足，總體的感官品質低，復蒸性能差[12]。關于傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團中優(yōu)勢乳酸菌——舊金山乳桿菌（L.sanfranciscensis）[13]對饅頭品質、風味及老化特性的系統(tǒng)研究尚屬空白。為解決傳統(tǒng)發(fā)酵主食饅頭工業(yè)化發(fā)展中實際問題和推進傳統(tǒng)發(fā)酵主食工業(yè)化發(fā)展進程，本文從實驗室保藏的51 株舊金山乳桿菌中篩選出1 株高產(chǎn)胞外多糖的舊金山乳桿菌Ls-1001，并將其應用于饅頭的制作，為今后老面饅頭工業(yè)化發(fā)展提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

51 株舊金山乳桿菌（L.sanfranciscensis）由本實驗室提供。

mMRS 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，牛肉浸粉10 g/L，麥芽糖20 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸銨 2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫80 1 mL/L，pH 5.4。

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、乙醇、三氯乙酸均為分析純級試劑。

香滿園優(yōu)質特精小麥粉，益海嘉里食品營銷有限公司；超市購買的某品牌活性干酵母。

LY01-3 厭氧培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設備有限公司；PHS-3C 型pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；SP-2000UV 紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；DSX-280B 型手提式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；YLY-XH-100AD實驗室超純水機，深圳市億利源水處理設備有限公司；SC-3614 低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；HC-3018R 高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；78-1 磁力加熱攪拌器，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 舊金山乳桿菌的活化與培養(yǎng) 將凍存的51 株舊金山乳桿菌分別接種到mMRS 液體培養(yǎng)基內，30 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱（N2∶CO2∶O2=79∶20∶1）內培養(yǎng)48 h，活化2～3 次后備用[14]?；罨蟮木喊大w積分數(shù)1%[15]的接種量接種到mMRS 培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)24 h 得到發(fā)酵液，待用。

1.2.2 舊金山乳桿菌胞外多糖的提取 舊金山乳桿菌發(fā)酵液中加入80%TCA，調節(jié)TCA 質量分數(shù)至4%[16]，4 ℃，10 000 r/min 離心20 min[17]，以除去菌體和蛋白質。向上清液中加入4 倍體積的無水乙醇[18]，4 ℃過夜放置，析出多糖絮狀沉淀。再次離心去除上清液，用蒸餾水溶解沉淀，裝入截留分子質量為8～14 ku 的透析袋中，透析8～12 h，透析液為蒸餾水。

1.2.3 舊金山乳桿菌胞外多糖的測定及高產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選 胞外多糖含量采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準品繪制標準曲線，計算EPS 產(chǎn)量[19-20]。

準確稱取100 mg 干燥的葡萄糖于500 mL 容量瓶中，蒸餾水定容。分別取標準葡萄糖溶液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL 加入具塞刻度試管中，補水至2.00 mL，再加入1.00 mL 體積分數(shù)5%的苯酚溶液、5.00 mL 濃硫酸混勻靜置，待其冷卻后于490 nm 波長處測定吸光度，同時以蒸餾水為空白，每組做3 次平行試驗。以糖含量（mg/L）為橫坐標，吸光度（A490nm）為縱坐標繪制標準曲線，建立回歸方程，求出胞外多糖含量，進而可初步篩選出EPS 高產(chǎn)菌株。

1.2.4 舊金山乳桿菌的應用

1.2.4.1 饅頭的制備方法 舊金山乳桿菌菌泥的制備：將培養(yǎng)24 h 的舊金山乳桿菌發(fā)酵液在3 000～4 000 r/min 離心4～5 min，棄上清，收集沉淀得到舊金山乳桿菌菌泥。

饅頭的制備采用二次發(fā)酵法，將舊金山乳桿菌菌泥溶于20 mL 自來水后，加入20 g 小麥面粉攪拌成面糊，在30 ℃發(fā)酵12 h，制備種面糊。向種面糊中加入2 g 活性干酵母、180 g 小麥面粉、90 mL 自來水，攪拌成團，30 ℃發(fā)酵60 min，分割成型，入鍋前醒發(fā)30 min，蒸制30 min，冷卻即得成品。

1.2.4.2 饅頭水分含量、比容的測定 饅頭水分、比容根據(jù)GB 5009.3-2016、GB/T 21118-2007 進行測定，試驗重復3 次。

1.2.4.3 酸面團pH 與總酸度的測定 稱取二次發(fā)酵的酸面團10 g，加入90 mL 蒸餾水，將酸面團搖勻，以pH 計測定酸面團的pH 值。用0.1 mol/L的NaOH 溶液滴定至pH 8.5 為止，記錄所消耗的NaOH 的體積即為該酸面團樣品的總酸度值，試驗重復3 次[21]。

1.2.4.4 饅頭的感官評價 測定感官評分規(guī)則：取冷卻時間在20 min 內的饅頭（此時記為0 h）測定0 h 感官評分，再將其在（25±2）℃放置48 h，分別測定放置24，48 h 的感官評分。

參考GB/T 21118-2007 感官分析方法（見表1），將饅頭切成數(shù)塊，由10 人品評小組進行品評，滿分100 分，試驗重復3 次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3 次，采用Excel 2013 和SPSS 15.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理，所有結果均采用Mean±SD 表示，顯著性分析（P<0.05，P<0.01）利用ANOVA 進行分析比較。

表1 感官評分表Table 1 Sensory score table

2 結果與分析

2.1 高產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選

對51 株舊金山乳桿菌胞外多糖產(chǎn)量的篩選結果如圖2所示，其中高產(chǎn)胞外多糖舊金山乳桿菌共7 株，分別為Hb1（187.31 mg/L），Gs7（185.47 mg/L），Ls-1001（190.32 mg/L），Gm2（183.70 mg/L），Hr8 （185.84 mg/L），Gs1 （186.60 mg/L），Gs5（188.48 mg/L），試驗結果表明同種不同株舊金山乳桿菌在產(chǎn)胞外多糖這一特性上具有差異性。由于Tinzl-Malang 等[22]研究發(fā)現(xiàn)將魏斯氏菌和費氏丙酸桿菌以1∶1 的比例發(fā)酵，胞外多糖產(chǎn)量為1.5 g/kg 面團，制備的面包的質構、感官及老化特性都得到顯著改善，可有效延長產(chǎn)品貨架期。此外，乳酸菌胞外多糖具有增稠性能，在面包生產(chǎn)過程中能代替膠體物質改善面團的流變性和機械加工性，使面包的體積增大，改善面包的質地，延長保質期，對面制品的老化有抑制作用[23]。因此選擇胞外多糖產(chǎn)量最高菌株舊金山乳桿菌Ls-1001 用于饅頭的制作。

2.2 饅頭的制作

通過測定胞外多糖含量篩選出一株高產(chǎn)胞外多糖舊金山乳桿菌菌株Ls-1001，其菌種保藏號：CGMCC No.14232，將其應用于饅頭的制作。試驗共分4 組，第1 組為對照組：活性干酵母（1 g/100 g面粉）饅頭；第2 組、第3 組、第4 組為試驗組，舊金山乳桿菌的添加量分別為9.75×1014，1.95×1015，2.93×1015CFU/100 g 面粉。

圖1 胞外多糖測定標準曲線Fig.1 Standard curve of determining EPS

2.2.1 饅頭水分含量、比容的測定 由圖3可知，與只添加活性干酵母發(fā)酵饅頭相比，舊金山乳桿菌的添加降低了饅頭的水分含量且添加量越大水分含量越低；第2 組、第4 組饅頭的水分含量隨著時間的延長逐漸下降，而第1 組與第3 組饅頭在貯藏過程中水分含量先增加后降低，原因可能是饅頭在貯存后期保鮮袋內環(huán)境濕度較大，可能導致饅頭吸收袋內水分而使水分含量增大，隨著淀粉的進一步老化，持水性下降從而使保水性有所下降[24]。由圖4可知，適當?shù)奶砑优f金山乳桿菌可增加饅頭的比容，當舊金山乳桿菌的添加量為1.95×1015CFU/100 g 面粉時，饅頭比容最大為1.97，結果表明舊金山乳桿菌能有效改善面制品結構。Corsetti 等[25]研究表明酸面團中優(yōu)勢乳酸菌舊金山乳桿菌（L.sanfranciscensis CB1）、植物乳桿菌（L.plantarum13）與釀酒酵母的復合發(fā)酵，具有增大面包體積的效果，與本試驗的研究結果相一致。

圖2 不同菌株EPS 含量Fig.2 EPS content of different strains

圖3 饅頭水分的測定Fig.3 Determination of moisture in steamed bread

2.2.2 饅頭酸面團pH 值與總酸度的測定 由圖5可知，隨著舊金山乳桿菌添加量的增加，酸面團的pH 值逐漸下降，總酸度逐漸增加，當舊金山乳桿菌添加量為1.95×1015CFU/100 g 面粉時，酸面團的pH 值最低為5.05，總酸度最高為7.97。以上兩點均證明舊金山乳桿菌在面團發(fā)酵過程中具有產(chǎn)酸現(xiàn)象。國內研究表明酵母菌和乳酸菌（Lactobacillus brevis）混合發(fā)酵面團與干酵母發(fā)酵相比，總酸度較高，麥芽糖、蔗糖、果糖等可溶性糖變化差異顯著[26]。Maligoy 等[27]發(fā)現(xiàn)與乳酸菌單獨培養(yǎng)相比，酵母菌和乳酸菌混合培養(yǎng)時，乳酸菌的mRNA 水平上158 個重要基因發(fā)生了明顯的調整，有54%的基因缺失表達，同時增加了46%的基因表達，而新增基因多是調節(jié)糖、氨基酸等代謝途徑的關鍵基因，而這些產(chǎn)物有可能是饅頭中的特征風味物質或者風味前體物質。

圖4 饅頭比容的測定Fig.4 Determination of specific volume of steamed bread

圖5 酸面團pH 值與總酸度的測定Fig.5 Determination of pH value and total acidity of sourdough

2.2.3 饅頭的感官評價 饅頭的感官評分如表2所示，在4 種饅頭中，添加了舊金山乳桿菌的饅頭感官評分均高于干酵母饅頭，且當舊金山乳桿菌添加量為1.95×1015CFU/100 g 面粉時即第3 組饅頭的感官評分最高為90 分。結合圖6可直觀看出第3 組饅頭在感官評價上滋味和氣味、口感、內部結構明顯高于其余3 種饅頭，而在表皮色澤、表皮結構、內部彈性上4 種饅頭感官評分相近，差異不明顯，其中干酵母饅頭的滋味和氣味感官評分最低。原因是乳酸菌利用面團中可發(fā)酵糖，產(chǎn)生乳酸、醋酸及丙酸等有機酸，可與酵母發(fā)酵中產(chǎn)生的醇、醛等物質相互作用，形成新的風味物質如揮發(fā)性酸等[28]，對饅頭的滋味和氣味有明顯的改善作用。而乳酸菌在酸面團發(fā)酵過程中合成的胞外多糖可以提高面團的勁度，改善面團的流變學性質以及面制品的結構品質[29]，因而添加了舊金山乳桿菌的饅頭品質優(yōu)于干酵母饅頭。

圖6 饅頭感官評價雷達圖Fig.6 Spider chart of sensory evaluation of the steamed bread

表2 饅頭感官評價得分表Table 2 The Sensory evaluation of the steamed bread

3 結論

本試驗以傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團中的優(yōu)勢菌種——舊金山乳桿菌為研究對象，通過苯酚-硫酸法篩選出一株高產(chǎn)胞外多糖舊金山乳桿菌菌株Ls-1001，其產(chǎn)量為190.32 mg/L。將其應用于饅頭的制作中，結果表明舊金山乳桿菌的添加能降低饅頭的水分，增加比容，降低酸面團的pH 值，增加總酸度，饅頭的感官評分最高，具有老面饅頭的香氣，口感最好，對改善干酵母饅頭的品質起到重要作用。