熱處理對丙二醛氧化米糠蛋白體外胃蛋白酶消化性質(zhì)的影響

吳 偉 尤翔宇 黃慧敏 吳曉娟

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室 長沙410004）

米糠蛋白的過敏性低，氨基酸組成合理，生物效價高，特別適合開發(fā)嬰幼兒配方食品，是一種極具開發(fā)潛力的優(yōu)質(zhì)植物蛋白[1]。然而，米糠極易酸敗變質(zhì)，并且米糠酸敗產(chǎn)生的脂質(zhì)氧化酸敗產(chǎn)物具有共價修飾蛋白質(zhì)的能力，可導(dǎo)致米糠蛋白氧化，進而影響其消化性質(zhì)[2]。脂質(zhì)氧化反應(yīng)極其復(fù)雜，其活性產(chǎn)物主要包括脂質(zhì)自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。脂質(zhì)自由基氧化修飾米糠蛋白的研究已有報道，而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物對米糠蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響尚不清楚[3]。丙二醛是脂質(zhì)過氧化生成反應(yīng)中最主要的產(chǎn)物，具有極高的氧化活力[4]。關(guān)于丙二醛氧化其它植物蛋白的研究已證實，丙二醛誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化形成的共價交聯(lián)聚集體會降低其體外胃蛋白酶消化率[5]。另外，米糠蛋白作為一種重要的食品原料，熱處理是其加工過程中不可或缺的處理方式。熱處理同樣會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而影響其消化性質(zhì)，并且絕大多數(shù)谷物蛋白加熱處理后的消化率都有所提高[6]。由此可見，米糠蛋白加工過程中，氧化修飾和熱處理對蛋白質(zhì)消化性的影響是并存的，而效果可能截然不同?，F(xiàn)有研究更多的是從不同氧化體系或不同加熱方式來探討氧化修飾或熱處理對蛋白質(zhì)消化性的影響，而鮮有關(guān)于它們共同作用的報道。本文以丙二醛代表米糠氧化酸敗中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，研究熱處理和氧化修飾對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化性質(zhì)的影響，以期為開發(fā)米糠蛋白及相關(guān)健康食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮米糠（酸價小于4 mg KOH/g 油，稻谷品種為秈稻中嘉早17），湖南長沙霞凝國家糧食儲備庫；1，1，3，3-四甲氧基丙烷，上海Macklin 公司；胃蛋白酶（900 U/mg），Biosharp 公司；肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品[細胞色素C（12 384 u）、抑肽酶（6 511 u）、桿菌肽（1 450 u）、氧化型谷胱甘肽（651 u）、Gly-Gly-Tyr-Arg（451 u）、Gly-Gly-Gly（189 u）]、ABTS，美國Sigma-Aldrich 公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

Sorvall LYNX 6000 高速落地離心機，美國Thermo Fisher 公司；LC-20 液相色譜儀，日本島津公司；TSKgel SW G2000 SWXL 色譜柱（300 mm×7.8 mm，5 μm），東曹（上海）生物科技有限公司；BlueStar 紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 米糠蛋白的制備 參考何莉媛等[2]的方法，將新鮮米糠與正己烷按料液比1∶4 混合脫脂，靜置30 min 去除上清液，重復(fù)脫脂5 次，將沉淀置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干，得到脫脂米糠。將脫脂米糠與去離子水按料液比1∶10 混合，用2 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 值至9.0，40 ℃下攪拌反應(yīng)4 h，將懸浮液在4 ℃，8 000 r/min 條件下離心15 min，取上清液用2 mol/L HCl 溶液調(diào)pH 值至4.0，靜置30 min后在4 ℃，8 000 r/min 條件下離心15 min 得到米糠蛋白沉淀。水洗沉淀3 次，將其分散于去離子水中，用2 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 值至7.0，冷凍干燥得到純度為83.75%的米糠蛋白。

1.3.2 丙二醛氧化米糠蛋白的制備 參考Wu等[4]的方法，采用1，1，3，3-四甲氧基丙烷水解法制備丙二醛儲液，根據(jù)波長267 nm 處的摩爾吸光系數(shù)31 500 L/（mol·cm）確定丙二醛濃度。將米糠蛋白溶解于0.01 mol/L pH 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液中，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為10 mg/mL （含0.5 mg/mL NaN3）。將米糠蛋白溶液與不同體積的丙二醛儲液混合，使得丙二醛終濃度分別為0，0.01，0.1，1，10 mmol/L，在25 ℃密封避光條件下中速振蕩24 h。反應(yīng)結(jié)束后，置于冰浴中使溫度迅速下降到4 ℃以下，隨后在4 ℃去離子水中透析72 h，除去未反應(yīng)的丙二醛，最后冷凍干燥得到丙二醛氧化米糠蛋白，將其置于4 ℃條件下待用。

1.3.3 米糠蛋白羰基、游離巰基和二硫鍵含量的測定 參考Wu 等[4]方法測定丙二醛氧化米糠蛋白的羰基、游離巰基和二硫鍵的含量。

1.3.4 熱處理丙二醛氧化米糠蛋白 將丙二醛氧化米糠蛋白溶解于去離子水中配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的懸濁液，在95 ℃條件下水浴30 min 后，在37℃條件下水浴15 min，恒溫備用。未經(jīng)熱處理的丙二醛氧化米糠蛋白溶液直接在37 ℃水浴45 min，作為對照組。

1.3.5 熱處理丙二醛氧化米糠蛋白體外胃蛋白酶消化程度的測定 參考何莉媛等[2]的方法，取1.3.4 節(jié)制備的樣品，用2 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 值到2.0，加入4 U/mg 胃蛋白酶，37 ℃保溫酶解1.5 h，沸水浴5 min 終止消化，10 000 r/min 離心10 min 后取上清液，用凱氏定氮法測定上清液中氮含量，計算米糠蛋白的消化率。

1.3.6 熱處理丙二醛氧化米糠蛋白體外胃蛋白酶消化進程的測定 參考何莉媛等[2]的方法，取1.3.4 節(jié)制備的樣品，用2 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 值到2.0，加入4 U/mg 胃蛋白酶，37 ℃下保溫酶解，分別酶解0，5，10，20，30，40，60，90 min 后，加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的三氯乙酸終止反應(yīng)，隨后在4 ℃，8 000 r/min 條件下離心15 min，取上清液測量波長280 nm 處的OD 值。為表征米糠蛋白體外胃蛋白酶消化進程，參考Bax 等[7]的方法引入擬合指數(shù)曲線方程和半衰期方程。

式中，ODmax——消化完全時穩(wěn)定的最大OD值；β——描述曲線形狀系數(shù)；t1/2——達到0.5 倍ODmax所需的消化時間，min；t——消化時間，min。

1.3.7 熱處理丙二醛氧化米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產(chǎn)物分子質(zhì)量的測定 取1.3.5 節(jié)中的上清液配制成0.6 mg/mL 的酶解液，用于測定米糠蛋白消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布。參考Chen 等[5]的方法，將肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL 的溶液，經(jīng)高效液相色譜儀分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，以保留時間為x 軸，相對分子量的對數(shù)為y 軸作分子質(zhì)量分布曲線：y=-0.2371x+7.1577 （R2=0.9856）。隨后將樣品過孔徑0.22 μm 的醋酸纖維素膜，再采用高效液相色譜儀進行分析。色譜柱：TSKgel SW G2000 SWXL （300 mm×7.8 mm，5 μm）；檢測器：紫外檢測器；流動相：0.1 mol/L，pH 6.8 含0.1 mol/L Na2SO4的磷酸鹽緩沖液；檢測波長：220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃。

1.3.8 熱處理丙二醛氧化米糠蛋白酶解物抗氧化能力的測定 取1.3.5 節(jié)中的上清液配制成0.6 mg/mL 的酶解液，用于測定米糠蛋白消化產(chǎn)物的抗氧化性。參考何莉媛等[2]的方法，測定米糠蛋白消化產(chǎn)物ABTS+·，DPPH·，·OH，O2-·的清除能力、金屬螯合能力以及還原能力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗平行測定3 次，采用Microsoft Excel 2003 和Origin 7.5 進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。指標(biāo)比較采用最小顯著差異法，取95%置信度（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙二醛濃度對米糠蛋白氧化程度的影響

羰基含量是衡量蛋白質(zhì)氧化程度最常用的指標(biāo)。我國生產(chǎn)的絕大部分米糠毛油的酸值范圍在15～40 mg KOH/g，對應(yīng)制備的米糠蛋白羰基含量約2～10 nmol/mg[3]。本文選用濃度為0，0.01，0.1，1，10 mmo1/L 的丙二醛溶液對米糠蛋白進行氧化修飾，得到羰基含量為2.00～10.34 nmol/mg 的丙二醛氧化米糠蛋白（表1）。由此可見，本文制備的丙二醛氧化米糠蛋白氧化程度與我國大部分米糠制備的米糠蛋白氧化程度相當(dāng)。丙二醛分子含有2 個羰基，當(dāng)其中一個羰基與蛋白質(zhì)分子中的伯胺反應(yīng)形成烯胺化合物，就會為蛋白質(zhì)引入羰基；丙二醛還會與蛋白質(zhì)游離氨基反應(yīng)生成席夫堿，造成蛋白質(zhì)羰基化[4]。如表1所示，隨著丙二醛濃度的增加，米糠蛋白羰基含量逐漸增加，表明丙二醛可導(dǎo)致米糠蛋白氧化。

半胱氨酸是最易受活性自由基（包括脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的活性醛、酮）氧化修飾的氨基酸之一，并且半胱氨酸巰基的氧化對蛋白質(zhì)交聯(lián)及其構(gòu)象變化起著至關(guān)重要的作用[8]。半胱氨酸巰基的氧化狀態(tài)可分為可逆氧化和不可逆氧化，可逆氧化主要形成二硫鍵和次磺酸，不可逆氧化主要形成亞磺酸和磺酸。由于羰基含量并不能反映半胱氨酸的氧化狀態(tài)，因而有必要采用游離巰基和二硫鍵含量表征米糠蛋白半胱氨酸的氧化程度。如表1所示，隨著丙二醛濃度的增加，米糠蛋白游離巰基含量由23.97 nmol/mg 逐漸減小至10.12 nmol/mg，二硫鍵含量由12.04 nmol/mg 逐漸增加至16.51 nmol/mg。二硫鍵含量的顯著增加，說明丙二醛氧化導(dǎo)致米糠蛋白巰基形成了大量以二硫鍵交聯(lián)的共價化合物。此外，游離巰基的下降幅度明顯大于二硫鍵的增加幅度，即總巰基含量也是下降的，說明丙二醛氧化還導(dǎo)致米糠蛋白巰基形成了非二硫鍵的含硫化合物。游離巰基和二硫鍵含量變化的結(jié)果顯示，丙二醛可導(dǎo)致米糠蛋白氧化，并且米糠蛋白的氧化程度隨丙二醛濃度的增加而增加。

表1 不同濃度丙二醛氧化米糠蛋白羰基、游離巰基和二硫鍵含量Table 1 Protein carbonyl，free sulfhydryl and disulfide of rice bran protein which oxidatively modified by different concentrations of malondialdehyde

2.2 熱處理對丙二醛氧化米糠蛋白體外胃蛋白酶消化率的影響

不同濃度丙二醛氧化的米糠蛋白體外胃蛋白酶消化率如圖1所示，隨著丙二醛濃度的增加，米糠蛋白消化率逐漸下降。Chen 等[5]研究丙二醛氧化修飾對大豆蛋白體外消化性的影響時發(fā)現(xiàn)，丙二醛氧化會抑制大豆蛋白體外胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化，并認(rèn)為該結(jié)果是由丙二醛氧化形成的共價交聯(lián)聚集體掩蔽了消化酶的識別位點造成的。由圖1可知，95 ℃水浴加熱處理丙二醛氧化米糠蛋白的體外胃蛋白酶消化率顯著高于未加熱處理的丙二醛氧化米糠蛋白（P＜0.05）。Zhou 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)處理溫度由室溫升高到100 ℃時，肌原纖維蛋白的胃蛋白酶消化率逐漸升高，并歸因于適當(dāng)溫度的熱處理可導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，空間結(jié)構(gòu)柔性增加，暴露出更多的胃蛋白酶結(jié)合位點。此外，隨著丙二醛濃度增加，熱處理對丙二醛氧化米糠蛋白消化率的提升作用越來越小，由最初的48.29%下降至34.21%。這可能是由于丙二醛具有極高的氧化活力，過高濃度的丙二醛會導(dǎo)致蛋白質(zhì)形成不易被胃蛋白酶消化的非二硫鍵交聯(lián)的共價聚集體，而熱處理并不能破壞這類共價鍵[5，9]。

圖1 熱處理對不同濃度丙二醛氧化米糠蛋白胃蛋白酶消化率的影響Fig.1 Effects of heat treatment on pepsin digestibility of rice bran protein which oxidatively modified by different concentrations of malondialdehyde

2.3 熱處理對丙二醛氧化米糠蛋白體外胃蛋白酶消化進程的影響

由圖2可知，米糠蛋白的體外胃蛋白酶消化進程是一個先快速水解，再緩慢水解直至穩(wěn)定的過程。通過對消化進程曲線進行擬合，得到擬合曲線參數(shù)。由表2可知，隨著丙二醛濃度的增加，ODmax逐漸下降，熱處理的丙二醛氧化米糠蛋白的ODmax顯著（P＜0.05）高于未經(jīng)熱處理的丙二醛氧化米糠蛋白，并且隨著丙二醛濃度的增加，熱處理對ODmax的提升作用越來越小，與米糠蛋白消化率的變化趨勢完全一致。半衰期隨著丙二醛濃度的增加而延長，熱處理可以顯著（P＜0.05）縮短米糠蛋白消化半衰期，表明丙二醛氧化會抑制米糠蛋白體外胃蛋白酶的消化進程，熱處理會在一定程度上促進不同濃度丙二醛氧化米糠蛋白的消化進程。由圖3可知，隨著丙二醛濃度增加，未經(jīng)熱處理的丙二醛氧化米糠蛋白胃蛋白酶初始消化速率持續(xù)下降，熱處理的丙二醛氧化米糠蛋白胃蛋白酶初始消化速率先不變后下降，熱處理顯著提高相同氧化程度米糠蛋白的體外胃蛋白酶初始消化速率（P＜0.05）。何光華等[10]研究發(fā)現(xiàn)，濕熱處理會改變蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，使原先位于分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部的酶催化位點暴露，進而提高乳清蛋白的消化速率。

圖2 熱處理對不同濃度丙二醛氧化米糠蛋白體外胃蛋白酶消化進程的影響Fig.2 Effects of heat treatment on pepsin digestion process of rice bran protein which oxidatively modified by different concentrations of malondialdehyde

表2 熱處理對不同濃度丙二醛氧化米糠蛋白胃蛋白酶消化進程擬合曲線參數(shù)的影響Table 2 Effects of heat treatment on the parameters of the fitting curve of pepsin digestion process of rice bran protein which oxidatively modified by different concentrations of malondialdehyde

圖3 熱處理對不同濃度丙二醛氧化米糠蛋白胃蛋白酶初始消化速率的影響Fig.3 Effects of heat treatment on the pepsin initial digestion rate of rice bran protein which oxidatively modified by different concentrations of malondialdehyde

2.4 熱處理對丙二醛氧化米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的影響

體外胃蛋白酶消化過程中，蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物分子質(zhì)量的變化是一個漸進過程，先降解成月示和胨，再水解成小分子肽。不同濃度丙二醛處理的米糠蛋白消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布如表3所示，熱處理組與未經(jīng)熱處理組的結(jié)果差異較大。隨著丙二醛濃度增加，未經(jīng)熱處理的米糠蛋白消化產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于500 u 以及500～1 500 u 的短肽含量逐漸下降，分子質(zhì)量大于8 000 u 的蛋白質(zhì)含量逐漸增大，可能是因為丙二醛誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化形成的可溶性聚集體不易被胃蛋白酶消化降解成短肽。經(jīng)熱處理后，不同濃度丙二醛處理的米糠蛋白消化產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于1 500 u 的短肽均有所增加，尤其是500～1 500 u 的短肽含量顯著增加，這表明95 ℃水浴加熱處理提高了米糠蛋白的水解程度。Kaur 等[11]和Wang 等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)臒嶙冃钥梢蕴岣叩鞍踪|(zhì)的體外模擬胃腸道消化率，生成較多的低分子質(zhì)量肽。

（續(xù)表3）

2.5 熱處理對丙二醛氧化米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產(chǎn)物抗氧化性的影響

米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產(chǎn)物具有抗氧化性已得到廣泛證實，并且相比于其它抗氧劑，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物具有多重抗氧化作用[13]。因而，本文采用自由基清除能力、金屬離子螯合能力和還原能力等多種體外抗氧化方法，來評價米糠蛋白消化產(chǎn)物的抗氧化性。隨著丙二醛濃度增加，未經(jīng)熱處理的米糠蛋白消化產(chǎn)物的ABTS+·清除率、DPPH·清除率、O2-·清除率、·OH 清除率、Fe2+螯合率和還原能力均持續(xù)下降。Chen 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)氧化會降低大豆分離蛋白的總抗氧化力和自由基清除能力。經(jīng)加熱處理的米糠蛋白消化產(chǎn)物的抗氧化性也隨著丙二醛濃度的升高而下降，然而總體上要高于未經(jīng)熱處理的米糠蛋白消化產(chǎn)物。Mora等[15]和Wang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，熱處理后消化產(chǎn)物抗氧化性的提高主要得益于活性肽的增加。此外，Abavominp 等[17]和Wattanasiritham 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，米糠蛋白抗氧化肽的分子質(zhì)量主要集中在500～1 800 u 和726～1 578 u 范圍內(nèi)。結(jié)合2.4 節(jié)米糠蛋白消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的結(jié)果推斷，丙二醛氧化降低了米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產(chǎn)物中活性肽（500～1 500 u）的含量，進而導(dǎo)致其抗氧化性下降；熱處理提高了相同氧化程度的米糠蛋白胃蛋白酶消化產(chǎn)物活性肽含量，從而提高其抗氧化性。

表4 熱處理對丙二醛氧化米糠蛋白胃蛋白酶消化產(chǎn)物抗氧化性的影響Table 4 Effects of heat treatment on the antioxidant properties of pepsin digestive products of malondialdehyde oxidized rice bran protein

3 結(jié)論

本文通過構(gòu)建丙二醛氧化應(yīng)激環(huán)境，誘導(dǎo)米糠蛋白氧化，采用95 ℃水浴熱處理，研究熱處理對丙二醛氧化米糠蛋白體外胃蛋白酶消化性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：丙二醛氧化導(dǎo)致米糠蛋白羰基含量和二硫鍵含量增加，游離巰基含量下降，表明丙二醛可導(dǎo)致米糠蛋白氧化。隨著丙二醛濃度增加，米糠蛋白體外胃蛋白酶消化率、初始消化速率和消化產(chǎn)物中分子質(zhì)量分布在500～1 500 u 的活性肽含量均逐漸下降。同時，消化產(chǎn)物的ABTS+·，DPPH·，O2-·，·OH 清除能力、金屬螯合率以及還原能力均持續(xù)下降。經(jīng)熱處理后，相同氧化程度的米糠蛋白體外胃蛋白酶消化率、初始消化速率、消化產(chǎn)物的活性肽含量和抗氧化性均有所增加，這表明，丙二醛氧化會降低米糠蛋白的消化性以及消化產(chǎn)物的抗氧化性，適當(dāng)?shù)臒崽幚頃谝欢ǔ潭壬显鰪娒卓返鞍椎南砸约跋a(chǎn)物的抗氧化性。本研究可為開發(fā)米糠蛋白及相關(guān)健康食品提供一定的理論參考，然而體外消化試驗中得到的結(jié)論還需要通過體內(nèi)胃腸消化試驗進一步證實，因此，下一步將采用動物模型研究熱處理對氧化米糠蛋白營養(yǎng)品質(zhì)的影響。