老陳醋來源乳酸菌的益生特性篩選及安全評價

許 女 賈瑞娟 李雅茹 張 浩 王如福

（山西農業(yè)大學食品科學與工程學院 山西太谷030801）

益生乳酸菌作為一種調節(jié)機體腸道菌群生態(tài)平衡的有益菌，其生理功能是多方面的，主要表現在調節(jié)腸道菌群，改善腸上皮細胞屏障功能，調節(jié)免疫應答，拮抗病原微生物，促進消化吸收，降低血清膽固醇及參與宿主的物質代謝等，目前被廣泛應用于食品、醫(yī)藥和工業(yè)發(fā)酵中。關于益生乳酸菌的篩選及開發(fā)研究多集中在乳制品、發(fā)酵肉制品、泡菜、酒、青貯飼料及人體腸道等方面。研究表明，乳酸菌是山西老陳醋整個發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細菌菌屬，具有抑制雜菌，產生乳酸（老陳醋第2主體酸成分，第1 主成分為醋酸）、乙偶姻（老陳醋重要功能成分川芎嗪的前體），平衡酸味，豐富協調香氣，增強食醋生理功能等重要作用[1]，而目前鮮有關于老陳醋中乳酸菌資源的益生特性及開發(fā)應用的報道。

乳酸菌作為食品發(fā)酵劑具有悠久的使用歷史，一直以來被認為是安全的 （Generally recognized as safe，GRAS），而近些年來關于傳統發(fā)酵食品來源乳酸菌安全性的負面報道時有發(fā)生，一些研究表明部分乳酸菌可攜帶抗性基因轉移至病原微生物[2]，引起耐藥性問題；一些雙歧桿菌具有體外降解粘蛋白的毒力能力[3]；隨著研究的深入，發(fā)現某些菌株能夠產生生物胺等有害代謝產物[4]。開展乳酸菌的安全性評價，對提高乳酸菌制品的質量安全以及保證人體健康具有重要意義。本文主要對山西老陳醋源乳酸菌進行益生特性篩選和系統安全評價，為其開發(fā)應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

健康昆明小白鼠，山西西科大學實驗動物研究中心，清潔級，體重（20±2）g。

乳酸菌菌株，分離自山西老陳醋醋醅，山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，生物工程實驗室保存；MRS 培養(yǎng)基，北京陸橋技術有限責任公司；膽鹽、膽固醇、DPPH、血管緊張素轉化酶（ACE）、生物胺、γ-氨基丁酸（GABA）、乙偶姻，北京索萊寶科技有限公司。細菌提基因組試劑盒，北京博邁德科技發(fā)展有限公司；Taq DNA 聚合酶、dNTP、10×聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）反應緩沖液、10×Loading Buffer，大連寶生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的益生特性測定 乳酸菌菌株的耐酸、耐膽鹽特性，DPPH、膽固醇的清除能力，ACE抑制活性，生物胺降解能力及產細菌素、γ-氨基丁酸和乙偶姻等益生特性試驗參考文獻[5-7]中報道的方法。

1.2.2 菌株的安全評價

1.2.2.1 毒力、產生物胺及耐藥相關基因的PCR擴增 參考文獻[8-9]等的引物序列，采用PCR 方法對20 株老陳醋源乳酸菌的毒力基因、生物胺產生相關基因及耐藥基因進行檢測，引物序列及擴增片段長度見表1。

1.2.2.2 菌株有害代謝產物評價 吲哚試驗、硝酸鹽還原酶、氨基脫羧酶活性、D-乳酸檢測參考文獻[10]中報道的方法。

1.2.2.3 菌株動物毒性實驗

1）受試菌液的制備 將試驗菌株按3%的接種量接于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，8 000 r/min，離心10 min，棄上清液，加入無菌生理鹽水，將菌體細胞洗滌2 次，調OD 值，使菌液濃度為1010CFU/mL 和108CFU/mL。

2）急性毒性實驗 將健康昆明小白鼠，分為4 組，每組12 只，雌雄各半，分別是對照組、植物乳桿菌172 組、植物乳桿菌173 組、發(fā)酵乳桿菌179 組。對照組灌胃0.85%的無菌生理鹽水，乳酸菌試驗組灌胃受試菌液，灌胃濃度為1010CFU/mL，劑量為0.5 mL/d。灌胃前1 d 小鼠禁食16 h，

不限飲水。灌胃后1，3，5，7 d 記錄小鼠體重變化，一般表現、行為及中毒表現。一般表現、行為及中毒表現主要包括：行為、動作、各種刺激反應、瞳孔大小、鼻孔、呼吸、糞便硬度、糞便顏色、皮毛、眼球、姿勢等。

3）30 d 喂養(yǎng)試驗 將健康昆明小白鼠分為7 組，每組8 只，雌雄各半，分別是對照組（灌胃0.85%的無菌生理鹽水）、植物乳桿菌172-1010組，植物乳桿菌172-108組（灌胃的受試菌液濃度分別為1010CFU/mL 和108CFU/mL，灌胃劑量為0.2 mL/d）、植物乳桿菌173-1010組、植物乳桿菌173-108組和發(fā)酵乳桿菌179-1010組、發(fā)酵乳桿菌179-108組。連續(xù)灌胃30 d，每天灌胃1 次，每天灌胃時間相同。

表1 乳酸菌菌株的毒力基因、產生物胺基因及耐藥基因的PCR 引物Table 1 Primer sequences of virulence factors，biogenic amine producing and antimicrobial resistance genes of lactic acid bacteria

每天記錄小鼠的一般表現、行為、中毒表現和死亡情況。每周稱1 次體重。將上述小鼠在第31天于無菌環(huán)境下解剖，在無菌范圍內用滅菌的手術刀將各個臟器切開，用無菌棉簽擦拭臟器剖面，涂布于MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察有無菌落生長；將各個臟器在無菌范圍內制備成組織抹片，進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察有無細菌易位現象。

對肝、腎、脾、心、肺稱重，制作石蠟切片，進行組織染色觀察。

2 結果與分析

2.1 菌株的16S rDNA 系統發(fā)育樹構建

分離自山西老陳醋醋醅中的20 株乳酸菌的16S rDNA 系統發(fā)育樹如圖1所示。其中5 株植物乳桿菌 （L.plantarum），5 株發(fā)酵乳桿菌 （L.fermenti），3 株戊糖片球菌（P.pentosaceu），2 株淀粉乳桿菌（L.amylovorus），3 株短乳桿菌（L.brevis）和2 株干酪乳桿菌（L.casei）。

圖1 基于16S rDNA 序列的20 株乳酸菌進化樹Fig.1 Dendrogram of LAB isolates based on 16S rDNA sequence

2.2 菌株的益生特性

本試驗對分離自山西老陳醋醋醅中的20 株乳酸菌菌株的耐酸、耐膽鹽特性，DPPH、膽固醇的清除能力，ACE 抑制活性，生物胺降解能力及產細菌素、γ-氨基丁酸和乙偶姻等益生特性進行研究，以期擴大其應用范圍，試驗結果見表2。益生菌必須對人體消化系統分泌的胃液、膽汁和胰液等消化液具有一定的耐受性。由表2可知，20 株乳酸菌菌株都表現出一定的酸和膽鹽耐受性，其中，植物乳桿菌171，172，173，175 和發(fā)酵乳桿菌178，179 的耐受性強于其它菌株，在模擬胃液（pH 2.0+0.1%胃蛋白酶）和模擬腸液（pH 7.0+0.1%牛膽鹽）中分別消化2 h 和24 h 后，活菌數仍然保持在106CFU/mL 左右。并且植物乳桿菌172，173 和發(fā)酵乳桿菌179 這3 株菌在后續(xù)篩選試驗中都呈現出良好的益生特性，具有較高的DPPH（65.35%，68.12%，60.38%）、膽固醇的清除能力（55.56%，60.52%，57.81%），血管緊張素轉化酶抑制（ACEI）活性（83.12%，80.05%，79.35%），生物胺降解能力（68.52%，60.32%，52.00%）及產細菌素（12800，12800，6400 AU/mL）、γ-氨基丁酸（0.92，1.03，0.99 g/L）和乙偶姻（0.35，0.52，0.37 g/L）的能力。

研究結果發(fā)現，大部分醋源乳酸菌的耐酸特性都較強，尤其是植物乳桿菌，這與種屬（植物乳桿菌的基因組通常較大，為3.35 Mb，而其它乳酸菌菌株的基因組為1.8～3.2 Mb，基因組大則可能含有的代謝及耐受基因數量多，表現出對外界不良環(huán)境適應性和抵抗性較其它菌屬強） 和所處的釀醋環(huán)境（醋醅pH 值為3 左右）對菌株的馴化作用有關。

老陳醋釀造的前期是酒精發(fā)酵，特別是在蘋果酸、乳酸發(fā)酵這一步，由于微生物（大部分酵母菌和一些細菌） 氨基酸脫羧酶的作用產生大量生物胺，經醋酸發(fā)酵后，使得生物胺的含量有所降低（具有降解生物胺能力的乳酸菌和醋酸菌）[11]，然而仍有部分生物胺殘留在最終的醋產品中，引起食品安全隱患。很多學者致力于研究具有降解生物胺能力的乳酸菌的篩選，并成功地應用于發(fā)酵酒類、泡菜、肉制品生產中[12-13]，而鮮有關于醋源降生物胺乳酸菌的篩選及強化應用在陳醋生產中的相關報道。

乳酸菌細菌素，作為一種抑菌蛋白，成為近年來乳酸菌界的研究熱點。乳酸菌作為老陳醋生產過程中的優(yōu)勢菌屬，除了具有產酸、協調香氣、平衡風味等重要作用，抑制有害雜菌是其另一重要功能，尤其在漫長的大曲制備（1 個月）、成熟過程中（3～6 個月），抑制雜菌生長、繁殖，保證主要功能菌群如霉菌、酵母菌和乳酸菌作為優(yōu)勢菌。將產細菌素的乳酸菌菌株應用到大曲制備中，對保證、提高成品曲的質量，降低食品安全風險具有重要意義。

川芎嗪，具有多種生物和藥理活性，被廣泛應用于心腦血管疾病、腎病、兒科疾病等病癥的臨床治療，是山西老陳醋的特征功效成分。乙偶姻是生成川芎嗪的重要前體物質，陳醋發(fā)酵過程中乙偶姻形成的代謝途徑和影響因素非常復雜，其中涉及到的主要菌種有酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和芽孢菌[14-15]。本文主要對老陳醋生產中高產乙偶姻的乳酸菌進行篩選，為今后將其強化應用在功能食醋產品開發(fā)上提供基礎研究。

氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）是山西老陳醋中又一重要潛在功能因子，具有改善神經功能、腦機能，抗癌，抗心律失常，健肝利腎等多種功效，已成為一種新型活性因子，廣泛應用于醫(yī)藥與食品領域并成為研究熱點。乳酸菌以谷氨酸或其鹽類為底物通過谷氨酸脫羧酶對底物進行脫羧從而合成GABA，是GABA 重要的生物合成方式，已經將其應用在功能酸奶、干酪、飲料、面包上，然而未見其應用在生產高附加值功能醋產品的報道。老陳醋以高粱、大麥等谷物為主要的生產原料，研究報道采用乳酸菌發(fā)酵谷物會產生大量GABA，這就使食醋作為富含GABA 的功能載體，與其它產品形式相比，具有不用額外添加底物谷氨酸鹽、輔酶磷酸吡哆醛、谷氨酸脫羧酶等優(yōu)勢，體現出良好的研究應用價值。

2.3 菌株的安全評價

近年來，乳酸菌安全性問題得到廣泛關注，傳統乳酸菌由于悠久的食用歷史，一直被認為是安全的（GRAS）。然而，有研究表明能夠從一些患者體內分離出乳酸菌，可能與菌血癥、心內膜炎、尿道感染等疾病有關。由于毒性及感染性因子具有菌株特異性，因此，對于新的具有潛在益生作用的乳酸菌菌株都必須進行安全評價。本文主要從毒力因子、耐藥性、有害代謝產物產生及體內毒理實驗等方面，對20 株醋源乳酸菌菌株進行了較系統的安全評價。

2.3.1 菌株的體外安全評價 根據國際上關于乳酸菌安全評價體系的內容，毒力因子的檢測非常必要，因為這些基因經常位于結合性質粒上，益生乳酸菌中攜帶的毒力基因可能來自于其它致病菌，如某些腸球菌，也可能水平轉移到其它菌種中，造成食品安全隱患。

asa1（聚合物，Aggregation substance）、esp（腸球菌表面蛋白，Enterococcal surface protein）和ace（黏附膠原，Adhesion of collagen）屬于黏附型毒力因子。聚合物的定植作用是致病菌感染宿主細胞最為關鍵的一步，有了這種黏附作用，腸球菌不僅可以調節(jié)自身的聚集也能促進腸球菌在宿主細胞上的定植，便于腸球菌感染宿主細胞[16]。gelE（ 明 膠 酶，Gelatinase）、hyl （ 透 明 質 酸 酶，Haluronidase）、cylA（細胞溶素，Cytolisin）屬于分泌型毒力因子。編碼明膠酶的基因gel 位于染色體上，約為1 520 bp，明膠酶不僅參與生物膜的形成過程，也降解宿主體內的膠原蛋白、纖維蛋白、抗菌肽和補體等，使機體的免疫系統遭到破壞，也可使腸球菌擴散或轉移至體內其它位置，增加感染幾率[17]。細胞溶素（Cytolisin），又名β-溶血素（βhemolysin），是革蘭氏陽性菌所產生的一類二肽物質，對原核生物和真核生物都能產生毒害作用，細胞溶素在動物體內的致病作用已有相關報道[18]。研究發(fā)現細胞溶素基因和聚合物基因通常位于同一個質粒上[19]，因此，腸球菌在合成細胞溶素的同時，也往往能夠生成聚合物。表3結果顯示，僅在2 株乳酸菌中檢測出hyl 基因，分別是植物乳桿菌175 和發(fā)酵乳桿菌180，另外一株戊糖片球菌183和干酪乳桿菌189 顯示出ace 陽性，其它毒力基因均未被檢出。

抗藥性是乳酸菌安全評價的重要內容。由于抗生素的不當使用，越來越多的乳酸菌具有耐藥性，或者攜帶耐藥基因，大部分耐藥基因位于可移動的非染色體遺傳因子上，可通過水平轉移進而傳遞給其它腸道菌株，甚至是致病菌中，導致超級耐藥細菌的產生，給人類的健康帶來嚴重危害。為初步探究乳酸菌的耐藥機制，本文檢測了大環(huán)內酯-林肯酰胺類（ermB，lnuA）及四環(huán)素類（tetM）、氨基糖苷類 （aac （6′）-aph （2″））、β-內酰胺類（blaZ）、和萬古霉素（vanX）等抗生素耐性基因在20 株醋源乳酸菌中的分布情況。表3結果顯示，ermB 和tetM 的檢測率較高，分別達到70%（14/20） 和65%（13/20），2 株淀粉乳桿菌顯示出blaZ和vanX 呈陽性，另外還有2 株干酪乳桿菌189、190 包含以上檢測的所有耐藥基因，為多重耐藥菌株。目前，關于乳酸菌的耐藥性研究主要集中在動物源、乳及乳制品中的分離菌株，鮮有關于傳統發(fā)酵食品如發(fā)酵肉類、泡菜、醋中乳酸菌的耐藥性研究報道[20]。本文研究結果顯示醋源乳酸菌的耐藥性可能成為食品安全隱患，除了加強禁止抗生素濫用規(guī)定外，應重視傳統發(fā)酵食品菌株的安全評價，今后需對耐藥質粒檢測，轉移機制、途徑等作進一步系統研究。

有害代謝產物的產生是乳酸菌安全評價的又一重要內容，包括氨基脫羧酶活性、硝酸鹽還原酶活性吲哚試驗及D-乳酸生成等。一些乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活性，它們能夠將食品中的氨基酸脫羧還原成生物胺類物質，若胺類物質在體內積累過多，則會引起中毒癥狀。

如表3所示，7 株菌中含有編碼酪氨酸脫羧酶的tdc 基因，5 株菌含有odc （鳥氨酸脫羧酶）基因，并未檢測出hdc（組氨酸脫羧酶）基因。并且在大多數陽性菌株中，含有tdc 基因的菌株同時攜帶odc 基因，如植物乳桿菌175 和3 株短乳桿菌186，187，188，這與欒同青[21]對黃酒釀造過程中分離的乳酸菌的檢測結果相似。試驗還進一步采用脫羧酶培養(yǎng)基檢測了菌株產生物胺的表型情況，試驗結果與PCR 結論一致（數據未給出）。孟甜[22]對26 株乳酸菌的檢測結果顯示其中6 株菌基因顯示陽性，而表型卻顯示陰性。脫羧酶培養(yǎng)基中加入了氨基酸前體物質，可以專一性的檢測到不同脫羧酶的活力，然而該方法易受外界因素的影響，如顯色劑、葡萄糖濃度、誘導劑、pH 值、氯化鈉濃度、氧氣等，也可能出現基因突變或基因“沉默”現象。報道稱產生物胺的乳酸菌分布在不同的種屬間，然而并無種屬特異性，因此必須對傳統發(fā)酵食品來源乳酸菌進行生物胺相關檢測，確保其安全使用。

硝酸鹽還原酶可以將食物中含有的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽可與食品中蛋白質分解產生的中間產物仲胺反應形成亞硝胺，亞硝胺可誘發(fā)多種癌癥。過量攝入D-乳酸或DL-乳酸則有可能引起代謝紊亂，甚至導致中毒。本試驗中所有菌株吲哚試驗、硝酸鹽還原酶、D-乳酸試驗均為陰性。

表2 食醋來源乳酸菌菌株的益生特性Table 2 Probiotic character of LAB isolates from Shanxi aged vinegar

表3 食醋來源乳酸菌菌株的體外安全性評價Table 3 Safety assessment in vitro of LAB isolates from Shanxi aged vinegar

2.3.2 菌株的體內安全評價

2.3.2.1 急性毒性試驗 在毒理學實驗中，受試動物的體重變化是機體各器官、系統發(fā)育狀況的總和，是反應受試物對機體影響的一項綜合性指標，可以作為評價受試物對機體影響的一項重要指標。本試驗以1010CFU/mL 的濃度分別灌胃小鼠，觀察7 d，各組小鼠生長、行為和精神狀況良好，皮毛整潔光澤，飲食、糞便等均正常，未見明顯的中毒癥狀，無死亡。各組體重增加趨勢如圖2所示，各試驗組小鼠體重增長趨勢正常，7 d 平均體重增長3.7～4.8 g，灌胃不同試驗菌液的試驗組小鼠體重與對照組相比，均無顯著性差異（P>0.05）。

2.3.2.2 30 d 喂養(yǎng)試驗 3 株試驗菌株的高劑量（1010CFU/mL）和低劑量（108CFU/mL）分別灌胃實驗小鼠30 d，各組小鼠的一般表現、行為和精神狀況良好，攝食、飲水、排泄正常，未見明顯的中毒表現，無死亡。體重增長正常，如圖3所示，試驗菌株各劑量組小鼠第1 周到第2 周平均體重增長3.6～5.3 g，以后每周體重增加趨于穩(wěn)定，每周平均體重增長1～2.5 g，各劑量組小鼠30 d 平均體重增長8～11 g。經方差顯著性分析，均無顯著性差異（P>0.05）。在關于乳酸菌對小鼠體重影響的研究中[23-24]，體重升高和降低皆有報道，可能與菌株特異性（某些乳酸菌具有減肥功效，而乳酸菌也具有促進食欲，幫助消化，營養(yǎng)吸收，增加體重的功能）及灌胃劑量、試驗周期有關。

圖2 急性毒性試驗中菌株對小鼠體重的影響Fig.2 The weight growth trends of mice for acute toxicity test （7 days）

臟器指數是各臟器與體重的一個比值，是毒理實驗中常用的指標，正常時比較恒定，當毒性反應發(fā)生后，受損臟器質量可以發(fā)生相應改變，故臟器指數也隨之改變。當臟器充血、水腫或增生肥大時，臟器指數增大。臟器萎縮及其它退行性病變時，臟器指數減小。30 d 喂養(yǎng)結束后對小鼠進行大體解剖，各組織器官正常，未見器質性病變，各臟器顏色正常，質軟，無腫塊。各試驗菌株對各組織器官的影響見表4和圖4所示，3 株試驗菌株及生理鹽水對照組的各試驗組小鼠的腎體比、脾體比、肺體比、肝體比、心體比與對照組小鼠相比，均無顯著性差異（P>0.05）。

由圖4可以看出，各組小鼠肝臟、腎臟、脾臟無異常變化。鏡下可見肝細胞無腫脹，肝小葉界限清楚，血竇內無充血現象，無異常細胞出現。鏡下可見腎小體毛細血管無異常改變，管壁細胞無腫脹，巧窠界限清晰。遠曲小管、近曲小管邊界清楚。髓質區(qū)各種小管整齊排列、分布。脾臟組織結構清晰，紅、白髓界限分明，白髓成熟淋巴細胞豐富，內含較多淋巴小結，脾索和脾竇排列整齊。綜上可見，肝臟、腎臟、脾臟均無任何特異性病理改變，說明灌胃試驗菌株對小鼠各組織器官無影響。

細菌易位是指原存在于腸腔內的細菌過度繁殖，在腸黏膜屏障損害和機體免疫防御功能低下等情況下，通過某種途徑越過腸黏膜屏障，進入腸系膜淋巴結、門靜脈系統，繼而進入體循環(huán)以及肝、脾、肺等遠隔器官的過程，從而激發(fā)全身性炎癥反應，導致膿毒癥，多臟器功能不全，甚至多臟器功能衰竭[25]。本文采用涂布的MRS 固體培養(yǎng)基和細菌抹片經革蘭氏染色鏡檢方法，考察3 株菌的易位情況，結果發(fā)現各個器官中均未見乳酸菌的生長，故無細菌易位現象發(fā)生。然而在腸道疾病或免疫力低下等情況下，是否會發(fā)生細菌易位，還有待進一步研究。

圖3 30 d 喂養(yǎng)試驗中菌株對小鼠體重的影響Fig.3 The weight growth trends of mice for toxicity test （30 days）

表4 30 d 喂養(yǎng)試驗試驗菌株對小鼠臟器的影響Table 4 The internal organ indices of mice for toxicity test （30 days）

圖4 30 d 喂養(yǎng)試驗小鼠臟器組織切片Fig.4 The organs tissue sections of mice for toxicity test （30 days）

3 結論

本文主要對20 株分離自山西老陳醋醅中的乳酸菌菌株進行了DPPH、膽固醇清除、生物胺降解、ACE 抑制等益生活性及產細菌素、γ-氨基丁酸和乙偶姻等功能活性代謝產物能力篩選，從中篩選出3 株優(yōu)良益生乳酸菌菌株：植物乳桿菌172，173 和發(fā)酵乳桿菌179。體外安全評價試驗及小鼠毒理實驗進一步證明了這3 株菌的安全性，為將其開發(fā)成益生菌制劑提供了基礎數據。另外，試驗結果還表明，這20 株分離自醋醅的乳酸菌菌株中，耐藥基因ermB 和tetM 的陽性率達到65%以上；部分菌株攜帶氨基酸脫羧酶基因；還有少量菌株含有hyl、ace 等毒力基因，因此對傳統發(fā)酵食品來源的乳酸菌菌株作安全評價十分必要。