鎮(zhèn)江香醋對(duì)非酒精性脂肪肝病小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

朱淑云 楊 靖 邵 鋒 董 英 余永建

（1 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江212013 2 江蘇恒順集團(tuán)有限公司 江蘇鎮(zhèn)江212143）

近年來(lái)隨著人們生活方式的改變，能量和膳食脂肪攝入的增加，非酒精性脂肪肝?。∟onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的患病人數(shù)逐年增加，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。更重要的是NAFLD 患者的年齡分布在向低齡化發(fā)展，在肥胖兒童中NAFLD 的發(fā)病率高達(dá)70%以上[1-3]。NAFLD 的發(fā)病機(jī)制與脂代謝紊亂、胰島素抵抗（IR）、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激等因素密切相關(guān)，現(xiàn)在臨床上尚無(wú)針對(duì)NAFLD 安全有效的藥物[4-6]。目前，NAFLD 的治療主要包括調(diào)整生活方式 （營(yíng)養(yǎng)和運(yùn)動(dòng)），增加胰島素敏感性，減輕炎性反應(yīng)以及保護(hù)肝細(xì)胞的藥物療法，然而相關(guān)藥物缺乏較理想的療效，并且往往成本較高，有較多的副作用。近年來(lái)一些天然活性物質(zhì)對(duì)NAFLD 的作用逐漸引起了人們的關(guān)注[7-10]。鎮(zhèn)江香醋（Zhenjiang aromatic vinegar，ZAV）具有顯著的抗氧化活性，其抗氧化活性成分包括黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)、維生素、皂苷類(lèi)和活性多肽等物質(zhì)[11-13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)江香醋具有保護(hù)肝臟的作用，香醋中的活性成分對(duì)肝臟組織損傷有修復(fù)作用，可以提高肝臟解毒功能，促進(jìn)其新陳代謝[14]。體外實(shí)驗(yàn)表明，食醋中的川芎嗪和外環(huán)二肽具有較好的降血脂功效[15]。NAFLD 的發(fā)病機(jī)制與肥胖和氧化損傷密切相關(guān)，而鎮(zhèn)江香醋是否對(duì)NAFLD 具有保護(hù)作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)通過(guò)高脂飲食建立NAFLD 小鼠模型，研究鎮(zhèn)江香醋對(duì)NAFLD 小鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

2月齡雄性ICR 小鼠40 只，江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2013-0011，所有小鼠均飼養(yǎng)于江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房?jī)?nèi)。

鎮(zhèn)江香醋（ZAV），鎮(zhèn)江恒順醋業(yè)有限公司。參考文獻(xiàn)[12]的方法將香醋在60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，其中濃縮醋的固形物含量為48.52%，總酚質(zhì)量濃度為12.21 mg/mL，總黃酮質(zhì)量濃度為6.42 mg/mL。

超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、游離脂肪酸（FFA）等試劑盒，南京建成生物工程研究所；胰島素ELISA 試劑盒、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒、白介素6（IL-6）ELISA 試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2 設(shè)備與儀器

T8 電動(dòng)均漿器，德國(guó)IKA 公司；L500 離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；AU2700 全自動(dòng)生化分析儀，日本Olympus 公司；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司；Ti-E 倒置熒光顯微鏡，日本Nicon 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4 組：正常組、模型組、ZAV 低劑量組、ZAV 高劑量組，每組10 只，經(jīng)1 周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，正常組小鼠喂養(yǎng)普通飼料，模型組小鼠喂養(yǎng)高脂飼料（70.5%普通飼料，10%豬油，10%蛋黃粉，8%蔗糖，1.5%膽固醇），ZAV 組小鼠喂養(yǎng)高脂飼料，分別每天灌胃1.2 g/（kg·d）和2.4 g/（kg·d）的ZAV，正常組和模型組小鼠灌胃等量蒸餾水。試驗(yàn)期間小鼠自由飲水、自由采食，每天固定時(shí)間灌胃，連續(xù)飼喂8 周。試驗(yàn)結(jié)束后，采血，引頸處死小鼠，迅速取肝組織和脂肪組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸去水分后，以電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取質(zhì)量，置潔凈塑料袋中密封，超低溫保存。

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè) 血清中的TG、TC、HDLC、LDLC和葡萄糖由全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；FFA、SOD、CAT、GSH、MDA、TNF-α 和IL-6 等指標(biāo)按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)血清葡萄糖和血清胰島素水平計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。

HOMA-IR=空腹葡萄糖水平 （mmol/L） ×空腹胰島素水平（mIU/L）÷22.5

1.3.3 肝組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取小鼠肝組織用10%中性福爾馬林固定，經(jīng)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各組數(shù)據(jù)結(jié)果以xˉ±SD （平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用SPSS17.0 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計(jì)組間差異，P ＜0.05 認(rèn)為組間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZAV 對(duì)小鼠體質(zhì)量和腹部及附睪脂肪質(zhì)量的影響

由表1可知，試驗(yàn)前各組小鼠的體質(zhì)量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），試驗(yàn)后模型組小鼠的體質(zhì)量顯著高于正常組（P<0.05），ZAV 可以顯著降低小鼠的體質(zhì)量，使其達(dá)到正常組的水平；模型組小鼠的腹部脂肪和附睪脂肪質(zhì)量也顯著高于正常組（P<0.05），說(shuō)明高脂飲食使小鼠體內(nèi)脂肪含量明顯增加，ZAV 可以顯著抑制小鼠脂肪含量的增加，高劑量組優(yōu)于低劑量組。

表1 ZAV 對(duì)小鼠體質(zhì)量和腹部及附睪脂肪質(zhì)量的影響（n=10）Table 1 Effect of ZAV on body weight，abdominal and epididymal fats in mice （n=10）

2.2 ZAV 對(duì)小鼠血清和肝臟中脂類(lèi)水平的影響

眾所周知，脂代謝紊亂是引起NAFLD 的重要因素，而長(zhǎng)期大量的高脂飲食必然引起脂肪合成加快和血脂升高，而TC 或TG 升高會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常。另外，F(xiàn)FA 增加被認(rèn)為是導(dǎo)致NAFLD 的重要起始因子，過(guò)量的FFA 會(huì)促使脂肪肝的形成，F(xiàn)FA 還可加重胰島素抵抗[16]。ZAV 對(duì)小鼠血清和肝臟中脂類(lèi)水平的影響見(jiàn)表2。

表2顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清和肝臟中的脂類(lèi)都顯著升高（P ＜0.05），表明高脂飲食導(dǎo)致小鼠體內(nèi)脂代謝紊亂，灌胃8 周后，ZAV 可以顯著降低血清TG 和FFA 水平（P ＜0.05），ZAV高劑量組還可以顯著降低血清LDL-C 水平和肝臟中TC 和TG 水平（P ＜0.05），而ZAV 組血清中的TC 與模型組無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）。HDLC可以將外源性膽固醇由組織細(xì)胞運(yùn)到肝臟代謝，其可以清除血管內(nèi)壁沉積的膽固醇，防止心腦血管疾病的發(fā)生，多數(shù)研究表明NAFLD 小鼠的HDLC 水平均下降[17-18]，而本試驗(yàn)中NAFLD 小鼠血清的HDLC 升高，可能由于大量外源性膽固醇的攝入促進(jìn)了HDLC 水平的升高，具體原因有待進(jìn)一步研究。表2結(jié)果表明ZAV 可以降低NAFLD 小鼠血清和肝臟中的脂質(zhì)水平，可以在一定程度上減緩NAFLD 的發(fā)生。

表2 ZAV 對(duì)小鼠血清和肝臟中脂類(lèi)水平的影響（n=10）Table 2 Effects of ZAV on the lipid levels in serum and liver of mice （n=10）

2.3 ZAV 對(duì)小鼠血糖、胰島素和HOMA-IR 的影響

胰島素是一種降血糖激素，可以促進(jìn)脂肪合成，抑制脂肪分解，過(guò)量的胰島素會(huì)引起肝內(nèi)脂肪堆積，導(dǎo)致脂肪肝的形成。而肝臟脂肪的堆積又可以進(jìn)一步誘發(fā)加重胰島素抵抗，胰島素抵抗在NAFLD 發(fā)展中起首要作用，是導(dǎo)致肝損傷的首要因素，因此改善胰島素抵抗是治療NAFLD 的關(guān)鍵因素之一，而增強(qiáng)胰島素的敏感性是改善胰島素抵抗的首要措施[19-20]。ZAV 對(duì)小鼠血糖、胰島素和HOMA-IR 的影響見(jiàn)表3。

表3 ZAV 對(duì)小鼠血清中葡萄糖、胰島素和HOMA-IR 的影響（n=10）Table 3 Effects of ZAV on glucose，insulin and HOMA-IR in serum of mice （n=10）

由表3可見(jiàn)，高脂飼料誘導(dǎo)模型組小鼠的血糖和胰島素水平較正常組顯著升高（P<0.05），小鼠產(chǎn)生了明顯的胰島素抵抗。灌胃8 周后，與模型組比較，ZAV 的干預(yù)顯著降低了小鼠的血糖和胰島素水平，改善了小鼠的胰島素抵抗。也有研究發(fā)現(xiàn)食醋可以延緩血糖的上升，從而使胰島素的分泌減少，并進(jìn)一步控制脂肪的合成，這可能與食醋中含有較多的有機(jī)酸有關(guān)[21-22]。

2.4 ZAV 對(duì)小鼠肝組織SOD 和CAT 活性及GSH 和MDA 含量的影響

氧化應(yīng)激在NAFLD 的發(fā)展中起到重要作用，肝臟中的脂質(zhì)過(guò)氧化是活性氧的重要來(lái)源，而過(guò)量的活性氧會(huì)進(jìn)一步加重肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激。SOD 和CAT 活性及GSH 含量可以反應(yīng)出機(jī)體的抗氧化能力，MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，可反應(yīng)組織氧化損傷程度[23-24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠肝臟SOD 和CAT 的活性及GSH 含量顯著降低，而MDA 含量顯著增加，說(shuō)明NAFLD 小鼠肝臟的抗氧化能力及對(duì)自由基的清除能力下降，脂質(zhì)過(guò)氧化損傷增加。ZAV 可顯著提高小鼠肝臟的SOD 和CAT 活性及GSH 含量，并降低MDA 含量。提示ZAV 可以提高機(jī)體的抗氧化能力，對(duì)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化有一定的抑制作用。許多研究也證實(shí)了食醋具有很強(qiáng)的抗氧化能力[11-13]，這與其含有較多的抗氧化物質(zhì)，如黃酮、多酚及類(lèi)黑素等有關(guān)[25-27]。

表4 ZAV 對(duì)小鼠肝組織SOD 和CAT 活性及GSH、MDA 含量的影響（n=10）Table 4 Effects of ZAV on activities of SOD and CAT，and levels of GSH and MDA in liver tissue of mice （n=10）

2.5 ZAV 對(duì)小鼠血清中TNF-α、IL-6 和脂聯(lián)素水平的影響

炎性因子在NAFLD 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，而TNF-α 和IL-6 是體內(nèi)兩種非常重要的炎癥細(xì)胞因子，它們既能直接損傷肝細(xì)胞，又能引起胰島素抵抗，從而促進(jìn)脂肪肝的形成[28-29]。而脂聯(lián)素是一種抗炎細(xì)胞因子，它可以通過(guò)抑制脂肪生成，提高線粒體內(nèi)游離脂肪酸的氧化，增強(qiáng)胰島素敏感性，從而降低肝臟脂質(zhì)的累積，減輕炎性因子的釋放[30]。

圖1 ZAV 對(duì)小鼠血清中TNF-α、IL-6 和脂聯(lián)素水平的影響（n=10）Fig.1 Effects of ZAV on serum TNF-α，IL-6 and adiponectin levels （n=10）

由圖1可知，NAFLD 小鼠血清中的炎癥細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6 顯著升高，脂聯(lián)素水平顯著降低，而ZAV 可以降低TNF-α 和IL-6 水平，升高脂聯(lián)素水平，提示ZAV 可以減輕NAFLD 小鼠的炎癥反應(yīng)，對(duì)脂肪肝小鼠有一定的保護(hù)作用。這可能與ZAV 能夠減輕肝組織脂肪的累積，具有較強(qiáng)的抗氧化活性有關(guān)。

2.6 ZAV 對(duì)小鼠肝組織形態(tài)的影響

由圖2可見(jiàn)正常組小鼠的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細(xì)胞大小均一，無(wú)脂肪變性。模型組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，大多數(shù)肝細(xì)胞腫脹，呈彌漫性脂肪變性，有的肝細(xì)胞呈氣球樣變性，而NAFLD 的主要特征是肝細(xì)胞脂肪變性和肝脂肪的異常累積，由此可以判斷高脂飲食導(dǎo)致了小鼠脂肪肝的形成，而ZAV 組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞脂肪變性程度較模型組有較大的改善，肝細(xì)胞基本恢復(fù)了正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)，說(shuō)明ZAV 可以減少NAFLD 的發(fā)生，這與其具有降脂、減重、抗炎、抗氧化的活性密切相關(guān)。

圖2 ZAV 對(duì)小鼠肝組織形態(tài)的影響（200×）Fig.2 Effect of ZAV on liver tissue morphology in mice （200×）

3 結(jié)論

鎮(zhèn)江香醋是我國(guó)傳統(tǒng)的四大名醋之一，其以優(yōu)質(zhì)糯米為主要原料，經(jīng)傳統(tǒng)的“固態(tài)分層”發(fā)酵工藝釀造制得，采用典型的天然多菌種混合發(fā)酵工藝。鎮(zhèn)江香醋富含多種活性成分包括黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)、維生素、皂苷類(lèi)和活性多肽等。本研究結(jié)果顯示，鎮(zhèn)江香醋對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD 有較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與其能夠降低小鼠的體質(zhì)量和脂肪含量，增加機(jī)體的抗氧化能力，減輕小鼠的胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)有關(guān)。然而本研究指標(biāo)有限，對(duì)鎮(zhèn)江香醋干預(yù)NAFLD 的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究，以獲得更精確的結(jié)論，為NAFLD 研究提供新的思路。