植物乳桿菌協(xié)同單甘油月桂酸酯促進小鼠增重并改善血脂水平和炎癥反應

李 楊 張 希 李 陽 馮鳳琴*

（1 浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術研究重點實驗室 浙江省食品加工技術與裝備工程中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點實驗室 杭州310058 2 青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 青島266109 3 云南中醫(yī)學院 昆明650500）

單甘油月桂酸酯（Glycerol Monolaurate，GML）是一種自然存在的乳化劑[1]，兼具優(yōu)良的乳化和抑菌功能[2]。1977年，美國食品與藥品管理局認定GML 為一般公認安全類（GRAS），2005年我國衛(wèi)生部批準其應用于各類食品中。GML 也被應用于動物飼料中發(fā)揮保健和營養(yǎng)作用。如0.4%GML 可提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能，并可抑制仔豬后段腸道中的有害微生物[3]；飼喂GML 提高了肉雞的生長性能、消化能力和雞肉營養(yǎng)品質(zhì)[4]。然而，本實驗室前期研究表明GML 在顯著促進小鼠增重的同時，引起血脂的異常變化，并誘導了促炎細胞因子升高及腸道菌群紊亂[5]。

益生菌，是一類當攝入足夠劑量時，可以對宿主產(chǎn)生有益影響的活的微生物[6]。益生菌的作用與胃腸道緊密相關，總結(jié)為3 個層次：1）直接作用于胃腸道（如與腸道菌群相互作用、調(diào)節(jié)pH 值等）；2）直接與腸黏液層和上皮細胞相互作用；3）影響全身免疫系統(tǒng)或胃腸道外的其它器官[7]。有著悠久使用歷史，通常被認為是安全的乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是過去幾十年中研究最多的益生菌門類[8]，尤其以乳桿菌屬和雙歧桿菌屬最為常見。植物乳桿菌是一種廣泛存在的乳酸菌，該種的一些菌株被證明具有益生特性，如降低膽固醇水平，調(diào)節(jié)腸道菌群，防治腹瀉和調(diào)節(jié)免疫等[9]。

本研究以雄性C57BL/6 小鼠為研究對象，飼喂添加GML 的基礎飼料的小鼠產(chǎn)生顯著性增重后，以本實驗室分離保存的植物乳桿菌T34 灌胃小鼠，觀測其對GML 飼喂小鼠的生長、血脂以及細胞因子等健康相關指標的影響，以期在維持GML 促生長效果的同時，緩解GML 對健康的不利影響，為GML 促進動物生長和健康的應用提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 植物乳桿菌ZJUFT34 篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團中，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC No.2017342。

1.1.2 實驗動物與飼料 4 周齡、體重相近的健康雄性C57BL/6 小鼠27 只，上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF 級實驗室。小鼠基礎飼料和含150 mg/kg GML 的基礎飼料，福貝世亨生物醫(yī)藥（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物乳桿菌ZJUFT34 菌粉的制備 將植物乳桿菌ZJUFT34 （T34） 接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)22 h。取菌液到無菌的離心管中，4 ℃，10 000×g 離心5 min 收集菌泥，用0.85%的無菌生理鹽水重懸離心清洗2 次后，菌泥重懸在5%脫脂乳和5%乳糖的凍干保護劑中進行凍干。收集的菌粉菌落總數(shù)為3.58×1011CFU/g，用生理鹽水配制成1×109～3×109CFU/mL 菌液用于小鼠灌胃，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 實驗設計 小鼠預飼喂1 周后，開始第1階段實驗（飼喂7 周），隨機分為2 個實驗組，對照CON 組3 籠，每籠3 只小鼠，飼喂基礎飼料；GML組6 籠，每籠3 只小鼠，飼喂含GML 的基礎飼料。飼喂7 周后，CON 組隨機取3 只小鼠，GML 組隨機取6 只小鼠，采集血清。隨后立即進行第2 階段實 驗，GML 組分為2 組，分別為GML-S 組 和GML-T34 組，處理方式如表1。實驗過程中每周稱量并記錄小鼠體重和飼料攝入量。實驗流程見圖1。

表1 第2 階段實驗動物分組Table 1 Animal grouping at the second stage

圖1 試驗流程圖Fig.1 Experimental process

1.2.3 小鼠血清的采集 采血前，小鼠禁食（不禁水）過夜（12 h）。禁食結(jié)束后，采用眼眶采血方式，收集小鼠新鮮血液，室溫靜置2 h，4 ℃，3 000 r/min 離心20 min，取上清，分裝在1.5 mL 無菌離心管中，于-80 ℃凍藏。

1.2.4 血清脂質(zhì)相關參數(shù)測定 血清中的總甘油三酯（TG）、總膽固醇（T-CHO）、高、低密度脂蛋白膽固醇（HDL-C，LDL-C）含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，并計算了HDL-C 與LDLC 的比值。

1.2.5 血清空腹血糖和胰島素含量測定 血清空腹血糖含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。血清胰島素的含量采用武漢基因美公司的ELISA 試劑盒測定。并按公式（1）計算穩(wěn)態(tài)模型-IR （Homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）[10]。

1.2.6 血清內(nèi)毒素（Lipopolysaccharide，LPS）和細胞因子的測定 血清內(nèi)毒素（LPS）含量采用武漢基因美公司的ELISA 試劑盒測定。血清細胞因子白介素（IL）-1β，IL-6，IL-10，腫瘤壞死因子（TNF）-α，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β 含量采用eBioscience公司的ELISA 試劑盒測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism version 6 進行數(shù)據(jù)分析并作圖，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t 檢驗，3組數(shù)據(jù)以上分析采用單因素方差分析并以Tukey’s檢驗進行多重比較。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（MEAN±SEM）表示。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義，以* 表示，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重變化結(jié)果

小鼠的生長情況見圖2和表2。第1 階段飼喂過程中，GML 組增重始終高于CON 組，除第3周外，2 組之間均有顯著性差異（圖2a）；第1 階段結(jié)束時，GML 組小鼠體重（28.44 g）比CON 組小鼠體重（26.17 g）平均增加了2.27 g（表2），且2 組之間的日采食量沒有顯著性差異。

第1 階段結(jié)束時，CON 組隨機取3 只小鼠，GML 組隨機取6 只小鼠，采集血液，以此作為后續(xù)干預的背景參照。第2 階段開始時（第7 周開始），GML-S 組和GML-T34 組的小鼠增重均顯著高于CON-S 組（圖2b），與第1 階段結(jié)果一致，具體體重見表2。第2 階段，對GML-T34 組的小鼠用T34 灌胃，3 周后各組的增重均沒有顯著性差異，比第1 階段任意3 周的增重顯著下降，且日采食量也均低于第1 階段，推測是由灌胃應激導致。雖然第2 階段3 組間的增重沒有顯著性差異，但是10 周的體重和第2 階段的日采食量GML-S 組和GML-T34 組均高于CON-S 組。

本課題組廣泛研究了GML 對不同動物生長情況的影響：（1）小鼠：包括本研究在內(nèi)的試驗結(jié)果均表明GML 能顯著提高小鼠體重[5]；（2）肉雞：150 mg/kg GML 雖未能增加肉雞的體重，但對其料肉比有降低的趨勢[4]；（3）育肥豬：150 mg/kg GML 劑量的飼料飼喂90日齡的育肥豬67 d，顯著增加了日均增重和體重[11]?；谝陨辖Y(jié)果和報道，150 mg/kg GML 對哺乳動物（小鼠、豬）的生長確有增重的作用。

據(jù)報道，植物乳桿菌P8 的攝入能增加肉雞的體重，且第22～42 天的增重顯著高于對照組[12]。Schwarzer 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，無菌小鼠攝入植物乳桿菌后的生長狀況接近于野生型小鼠，說明植物乳桿菌能維持小鼠的生長。本研究后期以灌胃形式給予小鼠3 周T34，其體重增重與未攝入T34 的GML-S 組以及對照CON-S 組無顯著性差異，說明3 周T34 的攝入未對體重增加產(chǎn)生顯著性影響。由于飼喂7 周時，GML 已引起體重顯著性增加，T34 攝入的3 周即使未增加體重，仍舊維持了GML-T34 組體重顯著高于CON-S 組的水平 （表2）。

圖2 小鼠體重變化Fig.2 Changes of body weight of mice

2.2 對血脂水平的影響

飼喂至7 周時，GML 雖未引起血脂水平的顯著性變化，但GML 能增加甘油三酯（TG）、總膽固醇（TCHO）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平，降低高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和HDLC/LDL-C 的水平（圖3）。本課題組前期研究表明，同劑量的GML 飼喂小鼠至8 周時，能顯著升高TG 和LDL-C，降低HDL-C 水平[5]，本試驗的變化趨勢與前期研究一致。

7 周時，將取樣后的GML 組小鼠隨機均分為2 組，GML-S 組和GML-T34 組，繼續(xù)飼喂3 周，并按照試驗設計進行T34 灌胃。至飼喂10 周結(jié)束時，飼喂GML 的2 組各項血脂指標與CON-S 組相比仍未見顯著性變化，而GML-T34 組的HDLC/LDL-C 比值顯著高于GML-S 組（圖4）。

LDL-C 能破壞舒血管和縮血管物質(zhì)的平衡從而促進血栓的形成，進一步促進動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，而HDL-C 可以通過抑制LDL-C 的氧化修飾進而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展[14]。Sekiguchi 等[15]研究證明，較高的HDL-C/LDL-C水平顯著降低了主要心血管不良反應發(fā)生的概率。有研究表明，攝入植物乳桿菌LP91 持續(xù)21 d，使SD 大鼠的T-CHO，TG，LDL-C 水平分別降低了23.26%，21.09%和38.13%，并且升高了HDL-C 的水平[16]。在第二階段，GML 明顯降低了HDL-C/LDL-C 比值，此結(jié)果提示GML 的使用有潛在的誘導心血管疾病發(fā)生的風險；而T34 的攝入使GML 組小鼠的比值顯著性升高 （圖4e），說明T34 的攝入能有效緩解GML 引起的HDL-C/LDL-C 水平的下降，進而有利于維持小鼠的健康。

2.3 對胰島素抵抗的影響

小鼠空腹血糖及胰島素含量結(jié)果見圖5，3 組的空腹血糖未見顯著性差異。GML 能顯著提高胰島素的含量，攝入T34 后，胰島素含量有所下降，然而仍顯著高于對照CON-S 組。HOMA-IR 指數(shù)的規(guī)律與胰島素含量相似。

胰島素抵抗是指單位濃度的胰島素的細胞效應減弱，即機體組織對胰島素的敏感性下降，代償性引起胰島β 細胞分泌胰島素增加[17]，它是2 型糖尿病的顯著特征之一，并且是最好的預測因子[10]。HOMA-IR（Homeostasis model assessment for insulin resistance）是臨床診斷胰島素抵抗的常用參數(shù)。在2 型糖尿病早期，胰島素水平越高，其胰島素抵抗程度就越嚴重。

胰島素含量的升高和HOMA-IR 指數(shù)的升高暗示GML 有可能使小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，而T34的攝入使這2 個指標的水平都有一定程度的下降，且與CON-S 組的差異有所減少，說明T34 能緩解GML 帶來的不利影響。

圖4 T34 攝入對小鼠血清脂質(zhì)水平的影響Fig.4 Effects of T34 administration on serum lipid levels in mice

圖5 T34 攝入對小鼠血清胰島素水平的影響Fig.5 Effects of T34 administration on serum insulin levels in mice

2.4 對血清細胞因子的影響

對小鼠血清脂多糖（LPS，僅第2 階段）、白介素（IL）-1β、IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β、腫瘤壞死因子（TNF）-α 含量進行測定，結(jié)果如圖6和圖7所示。

通過第1 階段小鼠血清的測定，觀察到GML能顯著升高促炎細胞因子IL-6 的水平，這種潛在低度炎癥的表現(xiàn)表明飼喂GML 至7 周對小鼠有潛在的不利影響。其余4 種細胞因子未觀察到顯著性變化（圖6）。

隨后，對飼喂GML 的小鼠分別灌胃生理鹽水和T34，相應的對照CON-S 組灌胃生理鹽水，3 周后進行血清各指標測定。GML-S 組和GML-T34組的LPS 水平略高于CON-S 組，說明GML 有升高LPS 的趨勢，而T34 的攝入未能改變GML 升高LPS 的趨勢。GML-S 組的促炎細胞因子IL-1β、IL-6（P<0.05）和TNF-α 水平高于CON-S 組；抗炎細胞因子TGF-β 水平顯著低于CON-S 組，IL-10變化較小。

植物乳桿菌的某些菌株具有很好的益生性能，有的已用于臨床實驗來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和緩解胃腸道疾病[18]。Pothuraju 等[19]研究表明，植物乳桿菌NCDC 625 能顯著降低高脂膳食引起的IL-6和TNF-α 轉(zhuǎn)錄水平的升高。在本試驗中，GMLT34 組的各細胞因子水平與其余2 組間均沒有顯著性差異 （圖7），而攝入T34 降低了IL-6 和TNF-α 水平且升高了TGF-β 水平，使之更接近于對照CON-S 組，說明T34 能緩解GML 引起的IL-6 水平升高和TGF-β 水平降低的趨勢。GMLT34 組的促炎細胞因子IL-1β 水平與GML-S 組相似，說明T34 對此細胞因子的影響小于GML。

圖6 GML 對小鼠血清細胞因子水平的影響Fig.6 Effects of GML on serum cytokines levels in mice

圖7 T34 攝入對小鼠血清細胞因子水平的影響Fig.7 Effects of T34 administration on serum cytokines levels in mice

3 結(jié)論

本研究表明，飼喂GML 可以使小鼠體重顯著增加，并能引起胰島素抵抗以及低度炎癥。GML增重作用適用于在動物生產(chǎn)中提高其生產(chǎn)性能，然而其誘導的低度炎癥反應以及血脂異常為GML 應用帶來潛在危害。本文嘗試使用一株植物乳桿菌ZJUFT34 對GML 的不良反應進行調(diào)節(jié)，植物乳桿菌ZJUFT34 的使用在保持GML 增重效果的同時，有效改善了血脂指標，優(yōu)化了膽固醇的組成（提高了HDL-C/LDL-C 的水平），緩解了胰島素抵抗，降低了促炎細胞因子IL-6，并上調(diào)了抗炎細胞因子TGF-β 的水平，很大程度上減輕了GML帶來的不利影響。GML 和植物乳桿菌ZJUFT34 配合使用，既保留了GML 促進生長的特點，又改善了機體血脂、胰島素和炎癥反應等指標，維持了機體健康，使其在動物養(yǎng)殖上具有良好的應用前景。