缺血再灌注損傷介導(dǎo)MRP2 表達(dá)下調(diào)對(duì)DCD 供體肝移植術(shù)后膽紅素代謝的影響

徐王剛，曾 仲，段 鍵，黃漢飛，李 珍

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院器官移植科，云南昆明 650032）

肝移植患者于術(shù)后早期常出現(xiàn)黃疸，血清總膽紅素增高為表現(xiàn)的并發(fā)癥，其原因與膽紅素轉(zhuǎn)運(yùn)障礙引起膽汁淤積有關(guān)[1-2]。膽汁的生成與轉(zhuǎn)運(yùn)需要線粒體供能，并由位于肝細(xì)胞細(xì)胞膜及膽細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成轉(zhuǎn)運(yùn)。如果轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能下降或供能出現(xiàn)障礙，就會(huì)出現(xiàn)結(jié)合膽紅素轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，引起高結(jié)合膽紅素血癥。本研究瞄準(zhǔn)肝結(jié)合膽紅素排泌過程中發(fā)揮了獨(dú)特重要作用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白—多藥耐藥 相 關(guān) 蛋 白 2（multidrug resistance protein 2，MRP2），采用肝移植患者肝組織，觀察MRP2 的表達(dá)。肝缺血再灌注導(dǎo)致的氧化應(yīng)激作用是供肝損傷的主要原因之一[3]。通過研究冷保存和缺血再灌注對(duì)MRP2 表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷對(duì)肝膽紅素排泌系統(tǒng)可能發(fā)生的損傷作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院器官移植中心2015 年6 月至2018 年10 月完成的DCD 供體肝移植24 例，其中，男性16 例，女性8 例，年齡21～60 歲，中位年齡38 歲。接受移植的受體原發(fā)病分類：14 例為肝炎后肝硬化失代償期，2 例為酒精性肝硬化失代償期，6 例為原發(fā)性肝癌（BCLC 分期A-B 期）。肝移植供體及受體術(shù)前總膽紅素值均小于34.4 mmol/L。移植手術(shù)方式：背馱式肝移植21 例，經(jīng)典肝移植3 例。器官熱缺血時(shí)間在3～5 min，冷缺血時(shí)間4～12 h。

1.2 研究方法

（1） 監(jiān)測(cè)移植受者術(shù)前術(shù)后肝功能情況，包括血清總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL） 水平；（2） 取材：供肝在獲取后冷保存時(shí)及移植術(shù)后完成血管吻合開放血流后分別取肝組織活檢送病理檢查。同時(shí)分別在冷保存和開放血流后剪取直徑3～4 mm 的組織塊，置于2 mL 凍存管，做好標(biāo)記，置于-70°C 液氮管保存；（3） 光鏡組織學(xué)檢查和電鏡肝組織學(xué)檢查：組織標(biāo)本經(jīng)固定、包埋、聚合、半薄切片、光學(xué)定位、切片、染色，行光鏡及電鏡觀察；（4） RT-PCR 檢測(cè)MRP2 基因mRNA 表達(dá)： （1） 肝組織總RNA 的提取；（2） 引物設(shè)計(jì)：參照Genebank 網(wǎng)站的基因系列，采用Primer Premier 軟件設(shè)計(jì)引物，MRP2 引物長(zhǎng)度283 bp，內(nèi)參β-actin 長(zhǎng)度318 bp；（4） 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；（5） PCR 反應(yīng)：94 ℃變性30 s；63 ℃退火30 s；72℃延伸30 s；共循環(huán)35 次；（6） PCR 產(chǎn)物結(jié)果檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間兩兩比較用卡方檢驗(yàn)，兩兩比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽紅素水平監(jiān)測(cè)結(jié)果

總膽紅素（TBIL） 術(shù)后第1 天起，TBIL 較術(shù)前明顯升高（P=0.01），但隨時(shí)間推移呈逐漸下降趨勢(shì)，術(shù)后第12 天TBIL 下降至術(shù)前水平，見圖1。DBIL/TBIL 比值 術(shù)前DBIL/TBIL 比值為（41.23±1.81） %，術(shù)后1 d DBIL/TBIL 比值升高為（59.25 ±1.87） %，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.032），見圖2。

2.2 光鏡下觀察移植前（冷缺血） 及移植后（再灌注） 肝組織標(biāo)本病理切片結(jié)果

肝移植前（冷缺血） 光鏡觀察可見肝竇的擴(kuò)張及肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變性（圖3），部分細(xì)胞核核固縮、核染色質(zhì)邊聚（圖4）。肝移植后（再灌注） 光鏡觀察見肝細(xì)胞腫脹、氣球樣變性較冷缺血期明顯加重，核固縮增加，細(xì)胞排列不整齊（圖5）；肝細(xì)胞索呈紊亂排列分布，匯管區(qū)可見有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖6。

2.3 電鏡下觀察肝移植供肝移植前（冷缺血） 及移植后（再灌注） 肝組織標(biāo)本

肝移植前（冷缺血） 電鏡觀察可見染色體在肝細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)邊聚現(xiàn)象（圖7）；線粒體排列分布混亂、線粒體體積增大、線粒體嵴減少或消失（圖8）；肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)多形性膽紅素顆粒，直徑約0.5～2.5 μm（圖9）；毛細(xì)膽管未見異常，毛細(xì)膽管內(nèi)未見膽紅素顆粒。肝移植后（再灌注）電鏡觀察可見細(xì)胞器腫脹較移植前加重，線粒體呈氣球樣改變（圖10）；細(xì)胞核內(nèi)染色體邊聚；細(xì)胞內(nèi)膽紅素顆粒較移植前增多（圖11）；但毛細(xì)膽管內(nèi)仍未見膽紅素顆粒，見圖12。

2.4 MRP2 在肝移植術(shù)前術(shù)后mRNA 水平的表達(dá)變化

分光光度法測(cè)量MRP2 及β-actin 條帶灰度值，結(jié)合內(nèi)參β-actin 表達(dá)量，了解MRP2mRNA表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)分析顯示：肝移植術(shù)后肝組織中MRP2mRNA 表達(dá)較肝移植術(shù)前明顯減少（P＜0.001，見圖13。

圖1 肝移植術(shù)前術(shù)后膽紅素變化趨勢(shì)Fig.1 Change of bilirubin before and after liver transplantation

圖2 術(shù)前術(shù)后DBIL/TBIL 比值的比較Fig.2 Comparison of DBIL/TBIL ratio before and after operation

圖3 肝竇的擴(kuò)張（黑箭頭） 及肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變性（紅箭頭） （×400 倍）Fig.3 Hepatic sinus expansion (black arrow) and hepatocyte ballooning degeneration （×400倍）

圖4 細(xì)胞核核固縮（紅箭頭） （×400 倍）Fig.4 Nuclear condensation (red arrow) （×400 倍）

圖5 肝細(xì)胞氣球樣變性加重（紅箭頭） （×400 倍）Fig.5 Aggravation of balloon-like degeneration in hepatocytes (red arrow) （×400 倍）

圖6 匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（×400 倍）Fig.6 Inflammatory cells infiltrate the portal area（×400 倍）

圖7 染色體邊聚（紅箭頭） （×10 000 倍）Fig.7 Chromosome edging (red arrow） （×10 000倍）

圖8 線粒體體積增大（紅箭頭） （×20 000）Fig.8 Increased mitochondrial volume (red arrow）（×20 000）

圖9 肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)膽紅素顆粒（紅箭頭） （×8 000）Fig.9 Bilirubin granules found in hepatocytes (red arrow magnified） （×8 000）

圖10 線粒體腫脹加重（紅箭頭） （×10 000）Fig.10 Increased mitochondria swelling (red arrow magnified） （×10 000）

圖11 細(xì)胞內(nèi)膽紅素顆粒較移植前增多（紅箭頭） （×8 000）Fig.11 Increased bilirubin particles in cells compared with that before transplantation (red arrow magnified） （×8 000）

圖12 毛細(xì)膽管內(nèi)仍未見膽紅素顆粒（紅箭頭） （×15 000）Fig.12 no bilirubin particles were found in the capillary bile duct (red arrow magnified） （×15 000）

圖13 肝移植術(shù)前術(shù)后mRNA 水平的表達(dá)變化Fig.13 Changes in mRNA expression before and after liver transplantation

3 討論

在肝移植和肝臟手術(shù)中，因?yàn)楦我浦彩中g(shù)過程中存在器官獲取和轉(zhuǎn)運(yùn)，肝臟手術(shù)中需要行第一肝門阻斷以減少術(shù)中出血等原因，肝缺血再灌注損傷是臨床上經(jīng)常發(fā)生的一種病理生理變化[4]。對(duì)肝缺血再灌注損傷機(jī)理的研究一直以來是肝移植和肝膽外科的研究熱點(diǎn)問題。目前已知的機(jī)理其發(fā)病機(jī)制主要包括以下幾點(diǎn)：細(xì)胞凋亡；炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；微循環(huán)障礙；氧自由基生成增加；各種炎性介質(zhì)釋放：例如黏附分子和白三烯；血小板聚集；能量代謝障礙；鈣超載；血管活性物產(chǎn)生：例如一氧化氮和內(nèi)皮素等；Kupffer 細(xì)胞激活；反應(yīng)性氧中間物的產(chǎn)生和釋放等[5]。

在筆者的前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝移植術(shù)后早期出現(xiàn)可出現(xiàn)以直接膽紅素的升高為主高膽紅素血癥[6]，以往對(duì)肝移植后膽汁瘀積原因的研究主要集中在形態(tài)學(xué)方面，將其歸因于肝缺血再灌損傷后的肝細(xì)胞和膽小管結(jié)構(gòu)的改變[7]。但我們?cè)诟我浦驳呐R床實(shí)踐過程中卻發(fā)現(xiàn)有些患者進(jìn)行肝移植術(shù)后出現(xiàn)明顯的選擇性膽汁瘀積癥，即這種膽汁瘀積僅僅表現(xiàn)為明顯的高結(jié)合膽紅素血癥，血膽汁酸及膽固醇水平卻保持正常，而這種選擇性的高結(jié)合膽紅素血癥不能用肝細(xì)胞的溶解和膽小管的形態(tài)改變所解釋，同時(shí)通過各種檢查（包括臨床生化檢測(cè)、膽道造影術(shù)、超聲檢查、CT 掃描以及肝穿刺活檢等）排除了急性移植物排斥反應(yīng)、大塊肝壞死及膽道并發(fā)癥。國(guó)外的研究也表明，肝移植術(shù)后供肝組織肝中央靜脈周圍的肝細(xì)胞明顯瘀膽，而非急性移植物排斥反應(yīng)所引起[7-8]。

膽汁的生成與轉(zhuǎn)運(yùn)需要線粒體供能，并由位于肝細(xì)胞細(xì)胞膜及膽細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成轉(zhuǎn)運(yùn)，肝細(xì)胞小管膜（頂膜） 中包含一系列轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些小管轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)生性和外源性代謝產(chǎn)物，穿過肝細(xì)胞小管膜排泄至膽小管的膽汁中[9]。如果轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能下降或供能出現(xiàn)障礙，就會(huì)出現(xiàn)結(jié)合膽紅素轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，引起高結(jié)合膽紅素血癥。MRP2 介導(dǎo)了多特異性結(jié)合型有機(jī)陰離子的排泄分泌，特別是結(jié)合型膽紅素的排泄分泌，它是唯一將結(jié)合型膽紅素從肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至毛細(xì)膽管內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[10-11]。經(jīng)以往研究發(fā)現(xiàn)MRP2 基因的表達(dá)水平與血清總膽紅素呈負(fù)相關(guān)[12]。缺血再灌注損傷導(dǎo)致線粒體損傷，引起能量代謝障礙，在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)冷缺血期線粒體發(fā)生腫脹，在再灌注期線粒體損傷進(jìn)一步加重，因此我們推測(cè)缺血再灌注損傷引起肝細(xì)胞線粒體功能障礙，導(dǎo)致MRP2蛋白功能下降，從而引起膽紅素從肝細(xì)胞內(nèi)至膽小管的轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)障礙，引起術(shù)后的高膽紅素血癥。

在本研究中，通過鏡下觀察，筆者發(fā)現(xiàn)冷缺血時(shí)供肝細(xì)胞的濁腫、肝竇的擴(kuò)張，線粒體腫脹，嵴減少，排列紊亂，細(xì)胞核內(nèi)染色體邊聚；肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)膽紅素顆粒，毛細(xì)膽管內(nèi)未出現(xiàn)膽紅素顆粒。這些都提示肝細(xì)胞缺血缺氧后出現(xiàn)細(xì)胞功能的障礙及肝細(xì)胞內(nèi)的膽紅素聚集。再灌注后細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，肝細(xì)胞內(nèi)膽紅素顆粒增加，提示有膽紅素轉(zhuǎn)運(yùn)障礙加重。通過熒光RT-PCR 法定量測(cè)定移植前后MRP2mRNA 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與術(shù)前比較術(shù)后MRP2mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)，結(jié)合肝臟組織檢查結(jié)果可知肝臟缺血再灌注損傷與肝臟中MRP2 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，筆者認(rèn)為：MRP2 作為膽紅素轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)降低是引起肝移植術(shù)后高膽紅素血癥的重要原因之一。缺血再灌注損傷引起肝細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致主要的膽紅素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-MRP2 的表達(dá)下降，從而引發(fā)膽紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，這可能是引起肝移植術(shù)后發(fā)生高膽紅素血癥的重要原因之。