嚴(yán)格厭氧嗜熱纖維梭狀芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶條件的優(yōu)化

章亭洲,朱廷恒，王騰浩，趙艷，沈煒

1(浙江科峰生物技術(shù)有限公司，浙江 海寧, 314423) 2(浙江工商大學(xué)，浙江 杭州, 310018)

纖維素是自然界中含量最多的一類碳水化合物，也是最廉價(jià)的可再生資源，纖維素主要存在植物細(xì)胞壁中[1]。纖維素酶是能催化水解纖維素生成葡萄糖的一類糖苷水解酶，又稱纖維素酶系[2]。纖維素酶系根據(jù)其功能的差異，主要分為三大類，分別為內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glcanohdrolase,EG)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase,CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase,BG)，它們?cè)诶w維素的水解過程中協(xié)同作用，高效降解纖維素。EG隨機(jī)水解纖維素非結(jié)晶區(qū)內(nèi)部的糖苷鍵，主要產(chǎn)生纖維糊精和低聚糖。CBH從纖維素鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖。BG水解纖維二糖和寡糖以釋放可發(fā)酵的葡萄糖[2,3]。纖維素酶廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)乙醇、食品、紡織、飼料等行業(yè)，我國有豐富的纖維素資源，開發(fā)高效的纖維素酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值[4]。

纖維素酶廣泛存在于微生物中，多種產(chǎn)纖維素酶活性較高的微生物已被發(fā)現(xiàn)和工業(yè)化應(yīng)用[5]。因真菌產(chǎn)纖維素酶系較全，分解纖維素能力較強(qiáng)，國內(nèi)外對(duì)降解纖維素菌研究多集中于真菌，比較典型的有木霉菌屬木酶屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)等[2-6]。

嗜熱纖維梭狀芽孢桿菌(Clostridiumthermocellum，以下簡稱嗜熱纖維梭菌,俗稱為梭熱桿菌)是一種嗜熱厭氧細(xì)菌，分泌大量纖維素酶，是目前自然界中已知的降解纖維素最高效的微生物之一，是利用纖維素生產(chǎn)生物能源和化學(xué)品的理想菌株[7-8]。嗜熱纖維梭菌中含有催化纖維素降解的纖維小體，它是由若干纖維素酶活性的催化單元與無催化活性的支架蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，使得它可以比真菌纖維素酶更緊密地結(jié)合到纖維素表面，從而高效降解底物[9-12]。嗜熱纖維梭菌產(chǎn)生的纖維素酶耐熱性好，但是由于熱纖梭菌是一種嚴(yán)格的厭氧菌，培養(yǎng)條件極其苛刻，分泌纖維素酶必須在高度厭氧的條件下進(jìn)行，且酶產(chǎn)量相對(duì)較低，我國目前尚未實(shí)現(xiàn)嗜熱纖維梭菌纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)，也很少見到有關(guān)該菌發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝優(yōu)化等基礎(chǔ)研究報(bào)道。

本文對(duì)從美國羅切斯特大學(xué)引進(jìn)的嗜熱纖維梭菌進(jìn)行了發(fā)酵工藝優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 菌株

嗜熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)ATCC 27405菌株[13]：由美國羅切斯特大學(xué)化學(xué)工程系J. H. David Wu教授提供。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g)：KH2PO41.5;K2HPO42.9;尿素2.1;MgCl2·6H2O 1.0;CaCl2·2H2O 0.15;FeSO4·7H2O 0.002 5;鹽酸胱氨酸1.0; Resazurin 2.0mg;纖維二糖5.0;嗎啉丙烷磺酸(morpholinopropane sulfonic acid，MOPS) 10.0;酵母提取物 5.0;二水檸檬酸鈉3.0。

種子培養(yǎng)基(g/L)：纖維二糖10，玉米漿12，檸檬酸三鉀鹽2，一水檸檬酸1.25，Na2SO41，KH2PO41，NaHCO32.5,NH4Cl 1.5，尿素5，酵母抽提物l，MgCl2·6H2O 50，F(xiàn)eCl2·4H2O 0.1，MgCl20.2，一水半胱氨酸鹽酸鹽1，二鹽酸吡哆胺0.02，對(duì)氨基苯甲酸0.004，D-生物素0.002，VB120.02，VB10.002，pH值自然。115 ℃濕熱滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：纖維二糖10，微晶纖維素10，玉米漿12，檸檬酸三鉀鹽2，一水檸檬酸1.25，Na2SO41,KH2PO41,NaHCO32.5,NH4Cl 1.5，尿素5，酵母抽提物1，MgCl2·6H2O 50,FeCl2·4H2O 0.1， CaCl2·2H2O 0.2，一水半胱氨酸鹽酸鹽1，二鹽酸吡哆胺0.02，對(duì)氨基苯甲酸0.004，D-生物素0.002，VB120.02，VB10.002，pH值自然。115℃濕熱滅菌20min。

1.3 纖維素酶酶活測定

酶活測定(濾紙酶活)參考文獻(xiàn)進(jìn)行[14]。

取50 mg濾紙(剪成1 cm×6 cm的濾紙條)，加1 mL pH 4.8的 50 mmol/L檸檬酸緩沖液，加入適當(dāng)稀釋含酶液(發(fā)酵上清液)0.5 mL，50℃反應(yīng)1 h，加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，加入20 mL去離子水，混合均勻后測定540 nm處的吸光值?？瞻讓?duì)照對(duì)應(yīng)加入500 μL檸檬酸緩沖液(50 mmol/L，pH 4.8)。以上酶活均扣除發(fā)酵液中的還原糖后計(jì)算酶活力，發(fā)酵培養(yǎng)基中的殘留乳糖通過高效液相色譜測定：Bio-Rad HPX-87P 色譜柱，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為5 mmol/L的稀硫酸，檢測器為示差檢測器。

酶活定義為每分鐘水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)活力單位。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.4.1 菌株活化

采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行菌株活化。將配制好的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基煮沸驅(qū)氧，而后用定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，每支10 mL，并插入通氮?dú)獾拈L針頭以排除氧氣。此時(shí)可以清楚地看到培養(yǎng)基內(nèi)加入的氧化還原指示劑刃天青由藍(lán)到紅最后變成無色，說明試管內(nèi)已成為無氧狀態(tài)，然后，蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，121℃滅菌20 min后備用。

將嗜熱纖維梭菌接種到培養(yǎng)管的培養(yǎng)基中，然后將培養(yǎng)管放入60℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 h。

1.4.2 發(fā)酵條件的探索

培養(yǎng)管中活化培養(yǎng)后的菌株接種到裝液量60 mL的100 mL厭氧培養(yǎng)瓶中進(jìn)行下列不同發(fā)酵條件的研究。對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH值分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，尋找最適條件。

設(shè)置不同的發(fā)酵溫度，分別為30、40、50、55、60 ℃，發(fā)酵72 h，發(fā)酵結(jié)束后測定纖維素酶活。

設(shè)置不同的培養(yǎng)時(shí)間，分別為24、48、60、72、84、96 h，60℃培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后測定纖維素酶活。

設(shè)置不同的培養(yǎng)基初始pH，分別為5.5、6、6.5、7、7.5、8，發(fā)酵結(jié)束后測定纖維素酶活。

1.5 發(fā)酵工藝探索

1.5.1 放大工藝下的纖維素酶發(fā)酵法

將活化的菌株按照2%的接種量轉(zhuǎn)接到50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，55℃恒溫培養(yǎng)24 h，得到一級(jí)種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)基裝入5 L發(fā)酵罐，裝液量3 L，滅菌結(jié)束后，向發(fā)酵罐通入氮?dú)?，除去培養(yǎng)基及罐內(nèi)氧氣。調(diào)節(jié)培養(yǎng)pH恒定為7，罐溫控制為55℃，然后接入一級(jí)種子液，停止通氣，間歇式攪拌發(fā)酵。保持發(fā)酵罐內(nèi)無氧狀態(tài)，厭氧發(fā)酵。

1.5.2 補(bǔ)料分批發(fā)酵制備纖維素酶

1.5.2.1 補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)的確定

將活化菌株接種到種子培養(yǎng)基中，然后以 2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，得到一級(jí)種子液，將種子液以5%的接種量接種到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，厭氧培養(yǎng)，罐溫控制為55℃，調(diào)節(jié)pH為7，間歇式攪拌。根據(jù)菌體生長情況和糖耗情況，分別在發(fā)酵開始后的16、20、24 h開始向發(fā)酵體系中緩慢添加纖維二糖溶液，流速為6 mL/h，上述纖維二糖溶液質(zhì)量濃度為200 g/L，比較產(chǎn)酶情況。

1.5.2.2 補(bǔ)料碳源的確定

將活化的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，然后以2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，得到一級(jí)種子液，將種子液以5%的接種量接種到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，厭氧培養(yǎng)，罐溫控制為55℃，調(diào)節(jié)pH為7，間歇式攪拌。發(fā)酵16～48 h，分別添加纖維二糖、微晶纖維素、木聚糖溶液，流速為6 mL/L，上述碳源溶液質(zhì)量濃度為200 g/L，發(fā)酵至60 h，比較產(chǎn)酶情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

嗜熱纖維梭菌是嚴(yán)格厭氧菌，進(jìn)行發(fā)酵條件研究時(shí)，保證發(fā)酵的無氧條件，厭氧發(fā)酵。

不同發(fā)酵溫度下的研究結(jié)果表明，嗜熱纖維梭菌在50～60℃的條件下相對(duì)酶活較高，可達(dá)90%以上，其中55℃時(shí)相對(duì)酶活力最高(圖1)。此溫度與報(bào)道的該菌的嗜熱特征和產(chǎn)纖維素酶的條件相似，因此，利用該菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的最適溫度應(yīng)為55℃。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)酶活影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on enzymatic activity

不同發(fā)酵時(shí)間的結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，酶活力呈上升趨勢，發(fā)酵至60 h酶活力達(dá)到峰值，96 h酶活開始下降(圖2)。所以發(fā)酵進(jìn)行60 h后停止，可以大大節(jié)約發(fā)酵成本。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活影響Fig.2 Effect of fermentation time on enzymatic activity

培養(yǎng)基不同初始pH值的研究結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為6.5～8時(shí)，相對(duì)酶活可達(dá)90%以上，最適培養(yǎng)基pH為7(圖3)。按照上述優(yōu)化條件即在55℃，初始培養(yǎng)基pH為7的條件下發(fā)酵60 h，測得酶活為5.12 U/mL，為未優(yōu)化的1.5倍。

圖3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)酶活影響Fig.3 Effect of initial fermentation pH on enzymatic activity

2.2 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.2.1 放大工藝下的纖維素酶發(fā)酵法

嗜熱纖維梭菌是嚴(yán)格厭氧菌，發(fā)酵放大工藝研究時(shí)維持發(fā)酵罐內(nèi)無氧條件，厭氧發(fā)酵。將保藏的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，然后，以 2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，得到一級(jí)種子液，將種子液以5%的接種量接種到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，厭氧培養(yǎng)，罐溫控制為55℃，調(diào)節(jié)pH為7，間歇式攪拌。發(fā)酵60 h酶活為12.37 U/mL。結(jié)果表明，發(fā)酵罐的放大培養(yǎng)條件下，嗜熱纖維梭菌產(chǎn)纖維素酶酶活顯著高于厭氧瓶條件下的酶活。

2.2.2 補(bǔ)料分批發(fā)酵制備纖維素酶的最佳時(shí)間

首先研究了根據(jù)嗜熱纖維梭菌生長曲線和糖耗的關(guān)系，結(jié)果表明菌體在16 h后進(jìn)入指數(shù)生長期，生物量顯著增加，此時(shí)糖的利用率最大(圖4)。根據(jù)菌體生長和糖耗情況，確定了補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)。分別在發(fā)酵開始后的16、20、24 h開始向發(fā)酵體系中緩慢添加質(zhì)量濃度為200 g/L纖維二糖溶液，流速為6 mL/h。比較產(chǎn)酶情況，發(fā)現(xiàn)0～12 h糖耗和生長情況較緩慢，進(jìn)入16 h后，菌體快速生長和糖耗進(jìn)入快速消耗階段，所以選擇16、20、24 h作為補(bǔ)料點(diǎn)。通過比較了不同補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)酶情況，發(fā)現(xiàn)從16 h的點(diǎn)開始補(bǔ)料，酶活最高，達(dá)到16.38 U/mL(表1)。發(fā)酵48 h后，菌體到達(dá)穩(wěn)定期，糖耗變緩，因此，確定補(bǔ)料時(shí)間為16～48 h。

圖4 嗜熱纖維梭菌生長和糖耗曲線Fig.4 Curve of growth and glucose use for Clostridium thermocellum

表1 不同補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)對(duì)酶活影響Table 1 Effect of different time of carbon addition on enzymatic activity

2.2.3 補(bǔ)料分批發(fā)酵制備纖維素酶的最佳碳源

對(duì)幾種可能提高嗜熱纖維梭菌纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)生酶活的碳源進(jìn)行了研究。發(fā)酵16～48 h，分別添加質(zhì)量濃度為200 g/L的纖維二糖、微晶纖維素、木聚糖溶液，流速為6 mL/L，發(fā)酵60 h后，測定酶活。酶活結(jié)果分析比較發(fā)現(xiàn)，添加纖維二糖的時(shí)候，酶活最高，達(dá)16.56U/mL(表2)。因此，纖維二糖為分批補(bǔ)料發(fā)酵條件下的最佳補(bǔ)料碳源。

表2 不同碳源對(duì)酶活影響Table 2 Effect of different carbon sources on enzymatic activity

3 結(jié)論

纖維素的分解和利用是當(dāng)今世界研究熱點(diǎn)之一，可以用于生物基能源生產(chǎn)、新型生物工藝和功能產(chǎn)品開發(fā)等，但轉(zhuǎn)化效率很低，高效纖維素酶、纖維小體的研究和開發(fā)應(yīng)用是突破瓶頸的關(guān)鍵[15-16]。纖維素酶已在轉(zhuǎn)化利用含纖維素物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料、食品和飼料原料加工、造紙業(yè)、紡織業(yè)等多個(gè)行業(yè)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用[17-19]。目前纖維素酶研究主要集中于真菌，但由于細(xì)菌相對(duì)真菌來說生長速率較高，所產(chǎn)纖維素酶的熱穩(wěn)定性和堿穩(wěn)定性高，用細(xì)菌產(chǎn)生纖維素酶的優(yōu)勢正在引起更多研究者的關(guān)注[20-22]。

嗜熱纖維梭菌是嗜熱厭氧細(xì)菌，產(chǎn)生纖維小體，纖維素酶具有耐高溫、催化活性高等明顯的優(yōu)勢[23-25],該菌產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件探索和優(yōu)化是利用其進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的前提。嗜熱纖維梭菌是嚴(yán)格厭氧菌，工業(yè)化生產(chǎn)條件要求苛刻，要確保發(fā)酵罐內(nèi)無氧條件，厭氧發(fā)酵。本文對(duì)該菌在發(fā)酵厭氧瓶水平上進(jìn)行了發(fā)酵條件探索，發(fā)現(xiàn)在55℃，初始培養(yǎng)基pH為7、發(fā)酵60 h為最佳條件，此時(shí)測得酶活為5.12 U/mL。此外，在放大的發(fā)酵罐水平上進(jìn)行了發(fā)酵工藝探索和優(yōu)化，根據(jù)菌體生長情況對(duì)分批發(fā)酵條件下的補(bǔ)料時(shí)間和添加碳源進(jìn)行了研究，放大和優(yōu)化后，該菌產(chǎn)纖維素酶的酶活由5.12 U/mL提高到16.56 U/mL，效果極顯著。研究結(jié)果為進(jìn)一步規(guī)?；墓I(yè)化生產(chǎn)降低成本和設(shè)計(jì)工藝提供了參考依據(jù)。