國蘭組培中外植體高效消毒方法分析

羅尚華

[摘要]國蘭是所有蘭屬植物中觀賞價(jià)值較高的一種植物，該種屬包含有蕙蘭、春蘭、春劍等。國蘭素有花中君子的美稱，蘭花整體呈現(xiàn)出花色淡雅、香味清幽的特點(diǎn)，無論是在文化價(jià)值方面還是經(jīng)濟(jì)價(jià)值方面都有著不俗的表現(xiàn)。組培技術(shù)作為為國蘭快速繁殖的主要技術(shù)，對于提高蘭花繁殖速度有著十分重要的作用。本文主要探究了國蘭組培中外植體高效消毒方法，希望能對蘭花組培技術(shù)人員有所參考。

[關(guān)鍵詞]國蘭;消毒方法;組織培養(yǎng);外植體;分析

[中圖分類號]S663.4

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

一般情況下，國蘭在自然條件下的萌芽率較低，并且都是通過分株的方式進(jìn)行繁殖。蘭花在生長過程中每年產(chǎn)生的新芽較少，導(dǎo)致分株繁殖系數(shù)難以提高，根本無法滿足當(dāng)前我國市場對蘭花的需求?；诖?，種植人員采用組培技術(shù)使得蘭花得以快速繁殖，提高蘭花的繁殖速率，使其能夠滿足當(dāng)前市場需求。目前我國國蘭組培工作已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，這一手段大大縮短了國蘭的生長周期。但是根據(jù)培育活動(dòng)的實(shí)際情況來看，其中存在有玻璃化、外植體污染等現(xiàn)象，往往導(dǎo)致國蘭組培工作難以成功，不利于國蘭健康生長。

1 材料與方法

本文研究以某地區(qū)國蘭不同部位外植體作為實(shí)驗(yàn)材料，在對這些外植體進(jìn)行培養(yǎng)過程中，通過應(yīng)用不同消毒方法、消毒時(shí)間以及消毒劑，設(shè)計(jì)了多種消毒方案，研究了國蘭的快速繁殖技術(shù)。

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

本次實(shí)驗(yàn)選擇某地區(qū)農(nóng)業(yè)生物輻照工程技術(shù)研究中心的組培研究室內(nèi)開展實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料有春蘭新芽以及蕙蘭種子。試驗(yàn)中需要應(yīng)用到的消毒劑有次氯酸鈉、乙醇等物，均通過正常渠道進(jìn)行選購。

1.2.1 酒精。酒精是外植體培育活動(dòng)中最常見的消毒劑類型之一，70%-75%的酒精殺菌效果最佳，應(yīng)用無水酒精或者95%的酒精開展殺毒工作會(huì)使得菌體表面的蛋白質(zhì)快速脫水凝固，最終在菌體表面形成一層干燥膜，這樣一來在一定程度上導(dǎo)致酒精的滲入效果大打折扣，無法達(dá)到預(yù)期的殺菌效果。

1.2.2 升汞。所謂的升汞又常被我們稱為氧化汞，該物質(zhì)能夠使得蛋白質(zhì)變性，最終起到殺死菌體的作用。具體而言，升汞的消毒效果最佳，但是需要注意的是，該物質(zhì)極易在植物材料上殘留，進(jìn)而導(dǎo)致完成消毒工作后需要應(yīng)用無菌水開展種子清洗清洗工作，并且升汞對于人畜毒害性較高，完成相關(guān)工作后一定要記得有效回收。

1.2.3 次氯酸鈉。該物質(zhì)是一種很好的消毒劑，在應(yīng)用過程中能夠釋放出大量的活性氯離子，進(jìn)而起到殺死菌體的目的，次氯酸鈉的消毒能力很強(qiáng)，但是對植物會(huì)產(chǎn)生一定的破壞作用，培育人員在應(yīng)用該物質(zhì)開展消毒工作時(shí)一定要對此引起重視。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

通過查閱大量資料，在試驗(yàn)過程中主要選用三種試劑，分別為75%的乙醇、10%的次氯酸鈉以及0.1%的升汞，將這三種消毒試劑進(jìn)行自由組合，設(shè)置不同的消毒時(shí)間，共組合出六種消毒實(shí)驗(yàn)組合，具體情況如下表所示。

在試驗(yàn)活動(dòng)中，首先將國蘭的外植體放置到封閉容器當(dāng)中，而后將不同的新芽與種子進(jìn)行消毒，再應(yīng)用無菌水將試驗(yàn)新芽以及種子沖洗6-8次，完成上述活動(dòng)之后將已經(jīng)準(zhǔn)備好的新芽與種子接種于培養(yǎng)基當(dāng)中。該培養(yǎng)基的主要組成內(nèi)容由活性炭2.0g/L、NAA3.0mg/L以及MS+6-BA1.0mg/L這三種物質(zhì)構(gòu)成。將國蘭種子當(dāng)做外植體的過程中，不同的蒴果大概需要接種10瓶，每瓶內(nèi)的種子大概有500顆。在將國蘭的新芽作為外植體時(shí)，每瓶只需要接種一個(gè)新芽。完成上述工作之后的15天，統(tǒng)計(jì)培植工作中的污染情況。隨后將其放置在2000Lx光照強(qiáng)度下，每天光照時(shí)間12h進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在該實(shí)驗(yàn)活動(dòng)中涉及到的所有數(shù)據(jù)都可以采用MicrosoftExcel軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑處理對蕙蘭種子的消毒效果

在本次試驗(yàn)活動(dòng)中，不同消毒劑對蕙蘭種子的不同處理結(jié)果如下表2所示。

由表2可知，在蕙蘭種子組培活動(dòng)中，采用0.1%升汞的消毒時(shí)間分別為3、5、8分鐘，在此高效消毒手段過后種子的污染率分別為24%、16%以及12%，由此可知，在應(yīng)用升泵溶液對蕙蘭種子進(jìn)行消毒時(shí)，在滅菌時(shí)間不斷增加的情況下種子的污染率呈現(xiàn)出逐漸降低的現(xiàn)象，種子培育工作較為理想。在應(yīng)用l0%次氯酸鈉開展消毒工作時(shí)，消毒時(shí)間分別為10、15、20分鐘，消毒后的種子污染率分別為36%、24%、16%，這一現(xiàn)象說明了10%次氯酸鈉對于蕙蘭種子的消毒效果與0.1%升泵溶液的效果十分類似。兩種消毒藥劑都會(huì)隨著時(shí)間的增長消毒效果越高，外植體的污染率越低?？偟膩碚f，0.1%的升汞相較于10%的次氯酸鈉而言，消毒效果更佳。在培育蕙蘭種子的過程中，因?yàn)榉N子的萌發(fā)時(shí)間較長，因此在檢查種子污染率時(shí)種子往往還未完全萌發(fā)，不能測量出種子的死亡率。但是從上述試驗(yàn)結(jié)果可知，蕙蘭種子在培育過程中，最佳消毒方式為0.1%升汞+75%酒精消毒8min的消毒方式。

2.2 不同消毒劑對春蘭新芽的消毒效果

由表3可以看出，應(yīng)用0.1%升泵對春蘭新芽進(jìn)行處理時(shí)，消毒時(shí)間分別為3、4、8分鐘，最終春蘭新芽的污染率為36%、24%、16%，產(chǎn)生的新芽數(shù)為2、3、1，這一現(xiàn)象說明了在種子培育階段，應(yīng)用0.1%升泵溶液開展處理工作時(shí)，隨著時(shí)間的延長，消毒處理的效果越好。但是結(jié)合實(shí)際種植情況來看，長時(shí)間的利用升汞溶液對蕙蘭種子進(jìn)行處理，極易導(dǎo)致蕙蘭新芽死亡，出現(xiàn)這一問題的根本原因在于升汞的毒性較大，長時(shí)間的消毒處理容易使得外植體死亡。在應(yīng)用10%的次氯酸鈉開展消毒工作時(shí)，消毒時(shí)間分別為10、15、20分鐘，春蘭新芽在此情況下最終污染率為48%、28%、24%。由上述結(jié)果可知，應(yīng)用10%次氯酸鈉在對春蘭新芽進(jìn)行消毒處理時(shí)，效果與0.1%升汞溶液十分相似，在實(shí)際操作過程中，消毒時(shí)間的增加會(huì)使得新芽的污染率逐漸下降。對試驗(yàn)活動(dòng)進(jìn)行全面觀察可以發(fā)現(xiàn)，春蘭新芽在次氯酸鈉消毒情況下，生長情況不是特別理想，出現(xiàn)此類現(xiàn)象的主要原因在于新芽的細(xì)胞分裂素以及生長激素濃度不合適導(dǎo)致?？偟膩碚f，在對春蘭新芽進(jìn)行處理時(shí)，最好的消毒方式為0.1%升汞+75%酒精消毒5min效果最佳，最終能夠獲得良好的春蘭新芽組培滅菌效果。

3 結(jié)論與討論

在開展國蘭培育工作時(shí)面臨的主要問題便是外植體的污染問題，一般情況下污染現(xiàn)象包含有病毒、細(xì)菌等微生物污染現(xiàn)象，這也是蘭花培育工作中影響出苗的重要指標(biāo)之一。在蘭花組培活動(dòng)中，通常污染現(xiàn)象都是細(xì)菌污染。導(dǎo)致污染的原因有外植體材料污染、培養(yǎng)基污染、接種員工違反相關(guān)操作規(guī)定等等，這些都是導(dǎo)致蘭花組培活動(dòng)發(fā)生污染現(xiàn)象的主要因素。細(xì)菌污染可以分為外生污染與內(nèi)生污染兩種，外生污染可能是因?yàn)槠骶呦静粡氐椎?，發(fā)生內(nèi)生污染的主要原因可能是因?yàn)橥庵搀w本身攜帶細(xì)菌導(dǎo)致，基于此，在組培活動(dòng)中選擇合適的外植體材料，采取合理的滅菌手段尤為重要。

目前在我國，針對蘭花組培活動(dòng)的研究較多，不少專業(yè)人士將國蘭的莖尖、根尖部分作為組培外植體開展組培工作，利用消毒劑對其進(jìn)行處理。根據(jù)筆者的試驗(yàn)結(jié)果來看，在培育蕙蘭種子的過程中，應(yīng)用75%乙醇45s+0.1%升汞消毒8min的效果最佳，在培育春蘭新芽的過程中，應(yīng)用75%乙醇45s+0.1%升汞消毒5min的滅菌效果最佳。具體來看，不同的外植體耐消毒劑的能力有所不同?；诖?，種植人員在培育國蘭的過程中，要結(jié)合實(shí)際情況，采取科學(xué)合理的培育手段，以提高外植體的成活概率。除此之外，相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還表明，應(yīng)用升汞消毒的效果優(yōu)于次氯酸鈉，但是在此過程中培育人員需要嚴(yán)格掌握消毒時(shí)間，切記不能消毒過度，以免導(dǎo)致外植體出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。此外，還需要應(yīng)用乙醇對外植體進(jìn)行溫和處理，以便能夠減少國蘭外植體的死亡現(xiàn)象。

在國蘭組織培養(yǎng)過程中，外植體受污染的概率較高，工作人員如何在培育工作中降低外植體的污染概率是培育工作主要面臨的問題。在此過程中，工作人員首先要選擇合適的殺菌劑，掌握正確的消毒方法。其次還需要在各個(gè)環(huán)節(jié)的培育工作中規(guī)范自身操作行為，杜絕各類污染現(xiàn)象的產(chǎn)生。例如在對國蘭外植體培育活動(dòng)中應(yīng)用到的培養(yǎng)器皿進(jìn)行消毒時(shí)，要合理增加培養(yǎng)器皿的高壓滅菌時(shí)間。在選擇外植體的過程中要盡量選擇無任何病蟲害、潔凈的外植體。在外植體接種工作中，一定要嚴(yán)格按照各個(gè)操作流程進(jìn)行操作，在外植體的培養(yǎng)基中可以適當(dāng)?shù)靥砑訛V殺菌后的抗生素，以便能夠有效降低外植體的污染率。

4 結(jié)語

綜上所述，相關(guān)人員在開展國蘭培育工作時(shí)，為了有效提高國蘭外植體的生存率，工作人員首先要選擇質(zhì)量較優(yōu)的外植體，隨后合理選擇實(shí)驗(yàn)活動(dòng)中應(yīng)用到的消毒劑，避免對外植體造成損害，探究出符合外植體發(fā)育的消毒手段，嚴(yán)格按照各個(gè)培育環(huán)節(jié)的規(guī)章制度開展培育工作，為提高國蘭培育質(zhì)量與效率打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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