蘆筍組培快繁技術(shù)研究

詹立平，張建軍，趙 鑫

(1.遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110101；2．遼寧生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110101)

蘆筍Asparagusofficinalis又名石刁柏、龍須菜，為百合科天門(mén)冬屬多年生草本植物，是一種藥食兼用的高檔蔬菜。在藥用方面，蘆筍具有抗腫瘤、降血脂、提高免疫力等功效[1]，而且這些功效已經(jīng)得到醫(yī)學(xué)驗(yàn)證，已有幾種以蘆筍為原料的藥品用于臨床[2]；在食用方面，蘆筍含有豐富的維生素B、維生素A、葉酸以及硒(Se)、鐵(Fe)、錳(Mn)、鋅(Zn)等微量元素，含有人體所必需的各種氨基酸。蘆筍含硒量高于一般蔬菜，在國(guó)際市場(chǎng)上享有“蔬菜之王”、“世界十大名菜之一”的美譽(yù)[3]。

20世紀(jì)60年代末以來(lái)，全球蘆筍種植面積呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。在全球蘆筍主產(chǎn)國(guó)中，中國(guó)的總產(chǎn)量名列第一，中國(guó)已成為世界蘆筍生產(chǎn)大國(guó)[4]。隨著蘆筍種植產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，提升蘆筍質(zhì)量、培育蘆筍新品種已成為現(xiàn)實(shí)需求。目前，蘆筍的新品種培育主要集中于全雄育種、多倍體育種以及分子標(biāo)記輔助育種等方面[5]。組織培養(yǎng)作為植物繁育的有效手段，已經(jīng)在多種藥用植物種苗培育中得到廣泛應(yīng)用。已報(bào)道的有關(guān)于蘆筍組織培養(yǎng)的研究中，多以葉片、莖段作為繁殖材料，但以種子作為繁殖材料的報(bào)道較少。

本研究以蘆筍種子為試驗(yàn)材料，探究蘆筍組織培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)以及生根培養(yǎng)的最佳激素配比，從而建立完善的蘆筍組培快繁體系。

1 材料與方法

1.1 材 料

從遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院試驗(yàn)田中選擇顆粒飽滿的蘆筍種子為試驗(yàn)材料。

1.2 方 法

1.2.1 消毒方法

將蘆筍種子用流水沖洗2 h，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)上，用0.1%升汞分別消毒4、6、8、10 min，無(wú)菌水沖洗10次，用消毒濾紙吸干種子表面水分，分別將種子一分為二，接種至附加2%蔗糖、0.7%瓊脂、pH值6.0的MS基本培養(yǎng)基中，每個(gè)處理50粒種子。培養(yǎng)室溫度(25±1) ℃，光照16 h·d-1，光照強(qiáng)度1 500 lx。相對(duì)濕度為70%～80%。15 d后統(tǒng)計(jì)污染率及萌芽率。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

將經(jīng)過(guò)消毒處理的蘆筍種子接種于附加6-BA(1.0 mg·L-1)和NAA(0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，未添加激素的培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理接種10粒種子，重復(fù)3次。培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.2.3 叢生芽的誘導(dǎo)

將愈傷組織接種至MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，分割成1 cm3大小，轉(zhuǎn)接至附加6-BA(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA(0.05、0.1、0.2 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基上，未添加激素的培養(yǎng)基為對(duì)照，誘導(dǎo)叢生芽。每個(gè)處理接種10塊愈傷組織，重復(fù)3次，45 d后觀察叢生芽誘導(dǎo)情況。

1.2.4 生根的誘導(dǎo)

將叢生芽誘導(dǎo)試驗(yàn)中分化得到的生長(zhǎng)旺盛、高度 2 cm以上的叢生芽，分割為每叢3～4株，接種至生根培養(yǎng)基中。基本培養(yǎng)基為1/2MS，附加0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1的IBA，每個(gè)處理接種20株叢生芽，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)生根率、根數(shù)以及根長(zhǎng)。

1.2.5 移 栽

移栽前，將生根幼苗的培養(yǎng)瓶移入溫室，揭掉封口膜，保持自然光照，溫度20～28 ℃，相對(duì)濕度 90%左右，培養(yǎng)2～3 d。待瓶?jī)?nèi)長(zhǎng)出新鮮的嫩葉后，用鑷子輕輕取出小苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽到泥炭土∶河沙=5∶1的基質(zhì)中，以泥炭土基質(zhì)為對(duì)照。移栽15 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用MINITAB 14對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)蘆筍種子無(wú)菌萌發(fā)的影響

由表1可以看出，隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)，污染率明顯下降，消毒效果顯著提升。當(dāng)消毒時(shí)間為4 min時(shí)，污染率達(dá)到24%；消毒時(shí)間為6 min時(shí)，污染率下降至10%；當(dāng)消毒時(shí)間等于或超過(guò)8 min時(shí)，外植體未被污染。但消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，升汞會(huì)對(duì)種子造成毒害，降低種子的萌發(fā)率。當(dāng)消毒10 min時(shí)，污染率為0，但萌芽率較消毒8 min降低了10%。因此，蘆筍種子表面消毒時(shí)間以8 min為宜。

表1 消毒時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響

2.2 激素配比對(duì)蘆筍愈傷組織誘導(dǎo)的影響

研究結(jié)果表明，培養(yǎng)4 d后種子開(kāi)始膨大，7 d后種子陸續(xù)發(fā)芽，芽苗逐漸長(zhǎng)高，20 d后在芽苗基部出現(xiàn)愈傷組織。

由表2可知，適宜的激素質(zhì)量濃度對(duì)蘆筍種子愈傷組織誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。添加6-BA 1.0 mg·L-1處理的誘導(dǎo)率最高，愈傷組織質(zhì)地松軟，長(zhǎng)勢(shì)好，色澤翠綠，而添加6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1和6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1的處理未能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。由此可以看出，隨著NAA質(zhì)量濃度增加，愈傷組織質(zhì)地由松軟到較硬，最后不能形成愈傷組織，說(shuō)明隨6-BA/NAA比值減小，對(duì)蘆筍愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生了抑制作用。

表2 激素配比對(duì)蘆筍種子愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 激素配比對(duì)蘆筍愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)的影響

由表3可知，對(duì)照處理沒(méi)有形成叢生芽；供試的激素配比均能促進(jìn)蘆筍叢生芽增殖，但不同質(zhì)量濃度的激素配比對(duì)蘆筍愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽存在明顯的差異。經(jīng)多重比較可知，添加6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1處理的蘆筍叢生芽平均株高最高，增殖系數(shù)最大。

表3 激素配比對(duì)蘆筍愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.4 蘆筍叢生芽生根培養(yǎng)

由表4可知，不同生根培養(yǎng)基上蘆筍叢生芽的生根率、根數(shù)存在顯著差異，根長(zhǎng)差異不顯著。當(dāng)IBA質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，根較為細(xì)弱，生長(zhǎng)不佳，不利于芽苗的養(yǎng)分吸收；當(dāng)IBA質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1和2.0 mg·L-1時(shí)，根系較為粗壯，但芽叢與根系間的愈傷組織過(guò)大，在移栽過(guò)程很容易在愈傷組織處發(fā)生斷裂；當(dāng)IBA濃度質(zhì)量為1.0 mg·L-1時(shí)，根生長(zhǎng)健壯，愈傷組織大小適宜，生根率和根數(shù)達(dá)到最優(yōu)，因此最適生根培養(yǎng)基為 1/2MS+IBA 1.0 mg·L-1。

表4 IBA質(zhì)量濃度對(duì)蘆筍叢生芽生根的影響

2.5 移栽馴化

在外界環(huán)境及管理措施相同的條件下，試管苗在泥炭土∶河沙=5∶1的基質(zhì)上成活率達(dá)到82%，且長(zhǎng)勢(shì)良好。而泥炭土為基質(zhì)的試管苗成活率僅52%，且長(zhǎng)勢(shì)較弱。因此，泥炭土∶河沙=5∶1的基質(zhì)為蘆筍試管苗適宜的移栽基質(zhì)。

3 討 論

以蘆筍種子為試驗(yàn)材料，采用0.1%升汞消毒8 min，污染率為0，發(fā)芽率可達(dá)到88%。比較以莖尖和莖段為外植體而出現(xiàn)的高污染率和低成活率[6]，種子消毒具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。這是因?yàn)榉N子有種皮的保護(hù)，且表面較光滑，消毒劑容易殺滅所攜帶的微生物。在種子萌發(fā)過(guò)程中，一方面利用自身的營(yíng)養(yǎng)成分，一方面攝取培養(yǎng)基中的養(yǎng)分，有利于幼苗的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，更易獲得健壯的初代無(wú)菌苗。

MS培養(yǎng)基中各元素濃度比例適中，可滿足植物的營(yíng)養(yǎng)和生理需要，本試驗(yàn)選擇MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。在植物組織培養(yǎng)中，對(duì)叢生芽誘導(dǎo)起重要作用的激素主要是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。本試驗(yàn)在愈傷組織誘導(dǎo)和增殖過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞分裂素6-BA 的質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織松軟、生長(zhǎng)量多，淺黃帶綠，表面具瘤狀突起。為了促進(jìn)芽器官分化，應(yīng)去除或降低生長(zhǎng)素濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例。當(dāng)細(xì)胞分裂素 6-BA與生長(zhǎng)素 NAA的質(zhì)量濃度分別為0.5 mg·L-1和0.2 mg·L-1時(shí)，株高和增殖系數(shù)明顯高于其它激素組合。生根培養(yǎng)時(shí)，盡量將3～4個(gè)芽苗(帶少部分愈傷組織)接種在一起進(jìn)行誘導(dǎo)生根，誘導(dǎo)的根系多且發(fā)達(dá)。此結(jié)果與高建明等[8]對(duì)抗莖枯病的蘆筍品種進(jìn)行離體培養(yǎng)的研究結(jié)果趨于一致。

此外，蘆筍根據(jù)嫩莖顏色常分為白蘆筍、綠蘆筍和紫蘆筍[9]，本研究選用的試驗(yàn)材料為綠蘆筍，后續(xù)研究過(guò)程中可針對(duì)不同顏色的蘆筍品種進(jìn)行比較，開(kāi)展品種間的培育研究。