MiRNA-153調控SNAI1在特發(fā)性肺間質纖維化中的抗纖維化作用

梁春聯(lián) 章琳 李秀麗

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種進行性且致死性的慢性肺疾病，患者常出現(xiàn)肺泡上皮細胞損傷，成纖維細胞過度增殖，間質細胞外基質明顯沉積的特征，但其病因尚不明確[1]。IPF患者中位生存期僅有2-3年[2]，并且流行病學調查發(fā)現(xiàn)IPF發(fā)病率逐年增加[3]。

MicroRNAs(miRNAs)是一類保守的19-22堿基長度的非編碼RNA，可以結合于靶基因的3’UTR端，抑制靶基因的翻譯或者促進mRNA降解。大量研究表明miRNAs在許多疾病發(fā)生發(fā)展過程中有著重要意義。研究表明，MiR-153參與神經退行性疾病發(fā)生，如帕金森病和阿爾茨海默病[4]。并且Liang等人[5]發(fā)現(xiàn)miR-153通過靶向抑制TGFBR-2表達，在特發(fā)性肺纖維中具有抗纖維化。另外，miR-153通過靶向上皮間質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)相關轉錄因子SNAII參與人類上皮癌EMT過程。而肺上皮細胞EMT過程與肺纖維化發(fā)生密切相關[6]。但miR-153與SNAI1在IPF中的相互作用機制及對IPF發(fā)生發(fā)展的影響尚未見明確報道。

資料與方法

一、IPF病人

所有患者(n=22)經臨床、影像學和特征性組織病理學特征，并符合美國胸科學會/歐洲呼吸學會共識標準(American Thoracic Society/European Respiratory Society)[7]。并根據患者的年齡以及性別選擇健康志愿者(n=22)，從所有參與者體內采集5mL血液樣本用于后續(xù)檢測。本研究中所有參與者均簽署書面知情同意書，并且經倫理委員會批準該項研究。

二、細胞培養(yǎng)

人胚肺成纖維細胞MRC-5以及HEK-293T細胞購自中國科學院細胞庫(上海)。CM7-1培養(yǎng)基(美國Gibco公司)用于培養(yǎng)MRC-5細胞，并補充10%胎牛血清(美國Hyclone公司)。HEK-293T細胞培養(yǎng)基為DMEM，同樣補充10%胎牛血清。所有細胞培養(yǎng)條件為5% CO2，37℃。

三、細胞轉染

細胞匯合度達到80%后，將MRC-5細胞接種到六孔板中，使得細胞密度為3×105mL-1。采用Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)，按照說明書指示向細胞中轉染miR-153,miR-153 inhibitor，pc-DNA3.1-SNAI1,miR-153+pc-DNA3.1-SNA1以及相應的陰性對照。

四、免疫印跡(western blot)分析

細胞轉染24h后，采用PBS緩沖液洗滌，向六孔板中加入150 μl/孔 的RIPA溶液(含有1mmol/L PMSF)。4℃條件下9 000rpm/min離心5min，收集上清液。采用Bradford法測定蛋白濃度后，40μg蛋白提取液用于十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。電泳結束后，將蛋白轉移PVDF膜上，TBST洗滌后加入脫脂牛奶，于4℃條件下封閉2h。之后加入待檢測蛋白對應一抗，4℃孵育過夜，隨后加入辣根過氧化物酶標記的二抗于37℃孵育1h。采用ECI plus分析蛋白表達水平，并以GADPH作為內參。本實驗中所有抗體購自Abcam公司。

五、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)

采用Trizol 試劑盒(美國Invitrogen公司)提取細胞或血液中總RNAs，并使用反轉錄試劑盒(miScript Reverse Transcription Kit,德國Qiagen公司)將RNA反轉錄為cDNA。采用IQ SYBR Green Supermix(美國Bio-Rad)進行定量。本實驗所用引物如下：miR-153: 5′-TTCCTTTGATTGCATAGTCACAA-3′(Forward)/5′-CCTCCACACACTCACCTCATC-3′(Reverse)；U6 snRNA: 5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′(Forward)/5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′(Reverse)；SNAI1: 5′-GCTGCAGGACTCTAATCCAGA-3′(Forward)/5′-ATCTCCGGAGGTGGGATG-3′(Reverse)；GAPDH：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′(Forward)/5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′(Reverse)。其中GAPDH作為mRNA內參基因，U6 snRNA作為miRNA內參基因。每個樣本檢測重復三次實驗，采用△△Ct法進行定量。

六、雙熒光素酶報告實驗

將預測的miR-153與SNAI1相互作用的3’UTR序列(野生型和突變型)克隆至psiCHECK-2 載體，位于海腎熒光素酶開放閱讀框下游構建為報告質粒，命名為SNAI1-WT(野生型)與SNAI1-MUT(突變型)。將HEK-293T細胞按照5×104個/孔的密度接種于24孔板中。按照操作說明書，采用LipofectAMINETM 2000將miR-153、SNAI1-WT與SNAI1-MUT及內參質粒SV40轉染到HEK-23T細胞中。24h后，采用雙熒光素酶試劑盒檢測熒光強度。

七、統(tǒng)計方法

結 果

一、miR-153及SNAI1的差異表達

檢測IPF患者和健康志愿者體內miR-153以及SNAI1 mRNA表達水平，結果(見圖1)所示。相對于健康志愿者，miR-153在患者體內顯著低表達(t=4.891，P<0.01),而SNAI1顯著高表達(t=5.791，P<0.01)。

圖1 miR-153及SNAI1表達水平

二、miR-153抑制纖維化

向MRC-5細胞中轉染miR-153 mimics、inhibitors以及scramble 序列(作為NC)，檢測細胞中α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、Ⅰ型膠原(Collagen Ⅰ)以及纖連蛋白(Fibronectin)的表達水平。結果(見圖2)所示，轉染miR-153 mimics 顯著抑制上述四種蛋白表達(F=32.06，P<0.01)，而轉染 miR-153 inhibitors則顯著促進上述四種蛋白高表達(F=24.11，P<0.01)。

圖2 miR-153對纖維化標志蛋白表達影響

三、miR-153調控SNAI1

有研究表明miR-153靶向SNAI1，抑制SNAI1表達。本研究采用雙熒光素酶實驗驗證miR-153與SNAI1之間的靶向關系，結果(見圖3)所示。圖3A表明SNAI1突變后，miR-153轉染不影響熒光素酶活力，而野生型SNAI1組熒光素酶活力受miR-153顯著抑制(t=8.125，P<0.01)。另外圖3B-D進一步表明轉染miR-153顯著抑制SNAI1 mRNA(F=16.26，P<0.01)以及蛋白表達.(F=27.68，P<0.01)。

圖3 miR-153與SNAI1靶向關系

四、miR-153通過SNAI1抑制纖維化

為了進一步證明miR-153通過抑制SNAI1表達的抗纖維化作用，本研究向MCR-5細胞中轉染pc-DNA3.1-SNAI1以及轉染miR-153 mimics+pc-DNA3.1-SNAI1，檢測細胞中纖維化標志蛋白表達水平，結果(見圖4)所示。過表達SNAI1(pc-DNA3.1-SNAI1組)顯著促進α-SMA，Vimentin，Collagen Ⅰ以及Fibronectin表達。但轉染miR-153 mimics后，四種蛋白的表達水平被抑制。

圖4 miR-153靶向SNAI1對纖維化標志蛋白表達影響

討 論

IPF是復雜的肺間質疾病，多種因素都可引發(fā)肺纖維化，但其具體的分子機制尚不明確。臨床上，IPF治療效果差，缺少特效藥。目前研究表明，EMT是肺纖維化發(fā)生的關鍵過程[6]。EMT發(fā)生過程中，成熟的上皮細胞逐漸失去其原有功能，成為間充質細胞，并且α-SMA，Vimentin，Collagen Ⅰ以及Fibronectin等纖維細胞特異蛋白表達水平顯著升高[8]。在此過程中TGF-β信號通路的激活起到了關鍵作用，在TGF-β1誘導下，人肺泡上皮細胞中的α-SMA，Vimentin，Collagen Ⅰ以及Fibronectin等蛋白表達顯著增加[9]。TGF-β1可以促進細胞內的SNAI1以及SNAI2蛋白表達，導致E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達抑制[10]。因此，SNAI1在IPF發(fā)生過程中具有扮演著重要角色。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SNAI1在IPF患者體內顯著高表達，因此，我們猜測調控SNAI1表達或許可以抑制IPF的發(fā)生和發(fā)展。

以往的研究表明miR-153具有抗肺纖維化作用，Liang等人發(fā)現(xiàn)miR-153調控TGFBR-2表達，從而降低人肺纖維細胞MRC中Fibronectin等蛋白的表達[5]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)miR-153在IPF患者體內顯著低表達。并且轉染miR-153 mimics會導致成纖維細胞中的纖維特異蛋白表達抑制，而轉染miR-153 inhibitors導致這些蛋白質表達增強。并且多個研究發(fā)現(xiàn)，miR-153在腫瘤細胞中可以調控SNAI1，抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲以及增殖[11-13]。而Xia等人發(fā)現(xiàn)miR-153可以通過調控SNAI1抑制肝癌細胞的EMT過程[14]。但miR-153與SNAI1在IPF中的相關調控機制及其作用尚未見報道。本研究通過雙熒光素酶實驗以及轉染miR-153 mimics和inhibitors驗證了miR-153抑制SNAI1表達(見圖3)。后續(xù)實驗結果也證明了轉染miR-153抑制α-SMA，Vimentin，Collagen Ⅰ以及Fibronectin等蛋白表達。

結 論

綜上所述，本研究表明，調控SNAI1的miR-153具有抗纖維化作用。然而，IPF患者中miR-153的失調和miR-153的治療價值需要進一步研究。