新型銪螯合物的合成及在時間分辨熒光免疫檢測嗜水氣單胞菌中的應(yīng)用

謝東琴，王艷，林鵬*

(1.集美大學 水產(chǎn)學院，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021；2.廈門華廈學院，福建 廈門 361021)

1942年Weissman[1]研究發(fā)現(xiàn)了稀土離子螯合物的特殊發(fā)光性質(zhì)，自此之后對稀土離子螯合物的研究一度成為科學界的熱點.稀土離子螯合物可作為優(yōu)良的發(fā)光材料，應(yīng)用于激光技術(shù)[2,3]、靜電紡絲[4,5]、光纖放大[6-8]、稀土熒光粉[9]、細胞成像[10]以及發(fā)光材料[11,12]等的研究.螯合物作為優(yōu)良的發(fā)光材料，其最大的特點是具有較長的熒光壽命，經(jīng)脈沖激發(fā)光照射后，通過儀器的時間分辨功能，延遲一段時間再測量螯合物的熒光強度，可有效避免來自復(fù)雜生物樣品、試劑和材料的短壽命熒光的干擾，進而極大地提高測定方法的靈敏度.

時間分辨熒光免疫分析技術(shù)(Time-resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA)是一種非放射免疫標記技術(shù)，是以抗原與抗體的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，以發(fā)出長壽命熒光的稀土離子螯合物為標記物，結(jié)合儀器的時間分辨功能而建立起來的一種免疫分析技術(shù).該法具有無放射性污染、標記物穩(wěn)定、操作簡便、靈敏、特異、安全、可靠等優(yōu)點[13].作為最靈敏的生物檢測技術(shù)之一，TRFIA在臨床診斷和生物技術(shù)中具有廣泛的應(yīng)用[14-20]，DELFIA體系是TRFIA法中的經(jīng)典，該體系所用熒光標記物本身的熒光強度較弱，免疫反應(yīng)發(fā)生后，需要引入解離增強液使得稀土離子與增強液中的配體形成新的強熒光螯合物，再進行熒光的測定，不僅增加了操作步驟，而且極易受到空氣中稀土離子的污染.合成出熒光強度高、帶有標記基團的固相稀土離子螯合物，可以彌補DELFIA體系的不足之處.

本文在前人研究基礎(chǔ)之上，首先合成配體4,7-二氯磺基苯-1,10-菲啰啉(4,7-bis(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthroline，BCP)，并將該配體同TTA一起與Eu3+進行螯合，得到新型固相稀土離子螯合物Eu(TTA)3(4,7-二氯磺基苯-1,10-菲啰啉)(Eu(TTA)34,7-bis(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthroline，EuTBCP).用生物素標記兔抗嗜水氣單胞菌抗體，EuTBCP標記親和素，然后采用固相TRFIA法檢測嗜水氣單胞菌B11，將細菌直接包被在微孔板上，加生物素化抗體，再加SA-BSA-EuTBCP，洗滌后可直接測量固相熒光.將該法用于檢測病鰻組織嗜水氣單胞菌，新合成的螯合物可用于水產(chǎn)致病菌的檢測.

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Victor X4 多標記分析儀(Perkins-Elmer公司)；Varioskan Flash全波長多功能酶標儀(Thermo Scientific Pierce公司)；Direct-Q3超純水一體化系統(tǒng)(Merck millipore公司)；6545 Q-TOF LC/MS(美國Agilent科技有限公司)；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo Scientific公司).

生物素標記試劑盒(24135)(Thermo Scientific Pierce 公司)；2-噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)、二甲亞砜(DMSO)(Sigma-Aldrich公司)；4,7-二苯基-1,10-菲啰啉(上海薩恩化學技術(shù)有限公司)；25%戊二醛水溶液(美國Ted Pella公司)；氯磺酸(山東西亞化學工業(yè)有限公司)；其它相關(guān)試劑均為分析純.

菌株B11分離于患病的日本鰻鱺，并經(jīng)Biolog 自動生化鑒定系統(tǒng)(GeneⅢ)鑒定為嗜水氣單胞菌，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No.M2018642.菌株B11接種于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，采用平板菌落計數(shù)法確定濃度，并調(diào)整濃度至 1×108cfu/mL備用.用福爾馬林滅活菌株制備菌苗，再用該菌苗注射兔獲得抗血清，抗血清通過SPA親和層析柱純化得到兔抗IgG，ELISA法測得其效價為1∶25600.

1.2 EuTBCP的合成

1.2.1 中間產(chǎn)物BCP的合成

合成路線設(shè)計：以4,7-二苯基-1,10-菲啰啉為底物，在高溫條件下，和氯磺酸發(fā)生氯磺酰化反應(yīng)，主要反應(yīng)方程式如圖1所示：

圖1 4,7-二氯磺基苯-1,10-菲啰啉合成路線

合成步驟：移取4.0 mL氯磺酸于三口燒瓶中，冰鹽浴冷卻30 min后，稱取4,7-二苯基-1,10-菲啰啉(664.8 mg，2 mmol)，固體加料漏斗分4批以1 min間隔將其加入到氯磺酸中，繼續(xù)攪拌30 min.油浴緩慢升溫至85 ℃，反應(yīng)進行6 h，薄層色譜(Thin-layer chromatography，TLC)法追蹤反應(yīng)進程，待生成的產(chǎn)物不再增加時停止反應(yīng).反應(yīng)液冷卻至室溫后，逐滴滴加到170 mL冰水中，邊滴加邊攪拌，立即有大量白色沉淀生成，真空抽濾，去離子水快速洗至中性，真空干燥10 h，稱重，避光保存在-20 ℃.

1.2.2 EuTBCP的合成

合成路線設(shè)計：見圖2

合成步驟：稱取Eu2O3(88.0 mg，0.025 mmol)溶解在1.0 mL濃鹽酸中，加熱至85 ℃蒸干得水合EuCl3，加入1.5 mL無水乙醇蒸干得EuCl3，再加入3 mL無水乙醇溶解EuCl3.稱取BCP(264.5 mg，0.5 mmol)溶于10 mL無水乙醇中，加入EuCl3乙醇溶液，60 ℃攪拌40 min，用NaOH乙醇溶液調(diào)節(jié)pH至6-7之間.稱取TTA(331.5 mg，1.5 mmol)溶于5 mL無水乙醇中，并將其逐滴加入到上述溶液中，60 ℃攪拌回流5 h.冷卻，抽濾，用冷的無水乙醇快速洗滌沉淀，真空干燥，得淺粉色固體產(chǎn)物，避光保存在-20 ℃[21].

圖2 EuTBCP的合成路線

1.3 生物素化IgG的制備

將抗嗜水氣單胞菌B11血清經(jīng)蛋白A親和層析法純化后，凍干，溶于適量磷酸鹽緩沖液(PBS)中，用BCA蛋白濃度測定試劑盒確定IgG原液濃度；取出適量IgG原液用PBS稀釋到1 mL，濃度為2 mg/mL；稱取1.1 mg 試劑盒中的生物素溶于200 μL水中，取出27 μL生物素溶液加入到IgG溶液中，4 ℃攪拌2 h；用試劑盒中的蛋白脫鹽柱對生物素化IgG進行純化.

1.4 親和素的EuTBCP標記

向0.6 mL的PBS(0.1 mol/L，pH 7.1)加入0.4 mg鏈霉親和素(SA)和0.4 mg牛血清白蛋白(BSA)；加入0.1 mL 2.5%戊二醛，4 ℃磁力攪拌24 h；加入0.4 mg NaBH4室溫孵育2 h；3 L 0.9% NaCl溶液4 ℃透析24 h，其間換透析液1次；加入10 mg NaHCO3，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.1；稱取1.5 mg EuTBCP溶在40 μL DMSO中，將其分4次以1 min間隔加入到上述溶液中，室溫攪拌1 h；4 ℃透析24 h，其間換透析液1次；收集標記物鏈霉親和素-牛血清白蛋白-EuTBCP(SA-BSA-EuTBCP)，保存在-20 ℃[22].

1.5 免疫反應(yīng)體系的建立

用碳酸鹽包被液將嗜水氣單胞菌B11菌液稀釋成不同濃度，每孔100 μL加入到96孔微孔板中，60 ℃包被12 h；每孔加入300 μL洗滌緩沖液洗板3次，每次3 min；加入200 μL BSA封閉液，37 ℃封閉2 h；洗滌3次，加入1∶200稀釋的生物素化IgG溶液100 μL，37 ℃震育90 min；洗滌3次，加入1∶200稀釋的SA-BSA-EuTBCP溶液100 μL，37 ℃震育90 min；洗滌6次，測量固相熒光.

2 結(jié)果與討論

2.1 高分辨率質(zhì)譜

圖3為產(chǎn)物EuTBCP(分子式：EuC48H29N2F9Cl2S5O10)的高分辨率質(zhì)譜圖.該物質(zhì)的M++H為1347.88 cm-1，目標峰向右的峰依次是在前一個峰的基礎(chǔ)上加一個氫原子的峰.

圖3 EuTBCP質(zhì)譜圖

圖4 EuTBCP紅外光譜圖

2.2 紅外光譜

2.3 螯合物熒光性能

圖5給出了濃度為1×10-5mol/L EuTBCP在DMSO中的時間分辨熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，測定所用儀器為Varioskan Flash全波長多功能酶標儀，測定條件為：延遲時間0.2 ms，激發(fā)狹縫12 nm，發(fā)射狹縫2 nm，積分時間1 ms，測量時間100 ms.

EuTBCP的熒光衰減曲線如圖6所示，測定所用儀器為Varioskan Flash全波長多功能酶標儀，測定條件為：激發(fā)波長352 nm，發(fā)射波長614 nm，激發(fā)帶寬12 nm，測量時間100 ms，積分時間0.1 ms.圖7為EuTBCP熒光衰減曲線及其擬合曲線，擬合曲線方程為y=314000e-0.003x，R2= 0.9997.螯合物熒光壽命870 μs.

圖5 EuTBCP時間分辨熒光激發(fā)和發(fā)射光譜

圖6 EuTBCP熒光衰減曲線

圖7 EuTBCP熒光衰減曲線及其擬合曲線

圖8 新型螯合物TRFIA法標準曲線

2.4 工作曲線及檢測限

利用1.5建立的新型螯合物TRFIA法檢測嗜水氣單胞菌B11，結(jié)果見圖8，標準曲線方程為lg TRF=0.0838 lg CFU+2.8081，R2=0.9868，線性范圍為1×105-1×108cfu/mL，檢測限1×105cfu/mL.

2.5 特異性實驗

利用建立的新型螯合物TRFIA法對菌株B11以及其他10株水產(chǎn)致病菌株進行交叉因素的測定.結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明抗嗜水氣單胞菌抗體與菌株B11有較強的陽性反應(yīng)，與其他菌株均無明顯交叉反應(yīng).表明建立的新型螯合物TRFIA法可以用于嗜水氣單胞菌的免疫檢測.

表1 新型螯合物TRFIA特異性測定

2.6 日本鰻鱺實際樣品檢測

利用新型螯合物TRFIA法對20份鰻鱺組織(肝、腎、鰓、腸、肌肉)樣品進行嗜水氣單胞菌的檢測，對照組以無菌生理鹽水代替組織樣品.結(jié)果見表2，有15份樣品呈陽性結(jié)果，陽性檢出率為75%，這說明新型螯合物TRFIA法可用于帶病鰻鱺的早期診斷.

表2 新型螯合物TRFIA法檢測日本鰻鱺組織樣品結(jié)果

3 結(jié) 論

設(shè)計合成了一種新型氯磺酰化的鄰菲啰啉衍生物配體，使用高分辨率質(zhì)譜和紅外光譜對其結(jié)構(gòu)進行鑒定，結(jié)果表明確系目標產(chǎn)物4,7-二氯磺基苯-1,10-菲啰啉，并將該配體同TTA一起與Eu3+進行螯合，得到新型固相稀土離子螯合物EuTBCP，熒光壽命長達870 μs，對螯合物進行時間分辨熒光光譜掃描，得到其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為352 nm和614 nm.

EuTBCP的氯磺酰基可以直接和蛋白質(zhì)連接，無需解離本身就可產(chǎn)生很強的長壽命熒光，具有一定的潛在應(yīng)用價值.將EuTBCP應(yīng)用于嗜水氣單胞菌的免疫檢測中，利用建立的新型螯合物直接TRFIA法檢測嗜水氣單胞菌B11，對20份患病鰻鱺樣品的檢測，結(jié)果表明該方法可用于水產(chǎn)致病菌的檢測.