REDD1 介導(dǎo)PI3K/AKT 通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞凋亡*

張衛(wèi)瑋，李芬，鐘幸

(1.江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，南昌330052；2.江西省腫瘤醫(yī)院淋巴血液科，南昌330029；3.江西省惠民醫(yī)院，南昌330046)

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤， 其死亡率占女性癌癥相關(guān)死亡率的第二位,晚期乳腺癌預(yù)后較差，臨床上迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)[1-3]。DNA 損傷反應(yīng)調(diào)節(jié)基因1 (regulated in DNA damage and development1，REDD1) 在正常組織中REDD1 低表達(dá)，而當(dāng)組織缺氧、細(xì)胞應(yīng)激、DNA 損傷可誘導(dǎo)REDD1 高表達(dá)[4]。 研究表明，REDD1 是一種新的癌基因，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、放化療敏感性密切相關(guān),抑制REDD1 表達(dá)可促進(jìn)中卵巢癌、腎癌、頭頸部鱗癌等細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖，然而其在乳腺癌中的作用及機(jī)制尚不明確[5-7]。 磷脂酞肌醇3 激酶(PI3K)在腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié)中起著重要作用[8,9]。 REDD1 是PI3K/AKT 通路的重要調(diào)控蛋白，REDD1 可磷酸化激活PI3K/AKT 通路， 抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖，幫助腫瘤細(xì)胞在不良環(huán)境中存活[10,11]。 本研究擬從REDD1 介導(dǎo)PI3K/AKT 通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞凋亡的角度，闡述REDD1 在乳腺癌中的生物學(xué)功能及機(jī)制，為乳腺癌提供潛在的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料和組織標(biāo)本 收集2017 年1 月-2018 年1 月江西省腫瘤醫(yī)院粗針穿刺活檢診斷為浸潤(rùn)性乳腺癌患者的術(shù)后新鮮標(biāo)本30 例（乳腺癌腫瘤組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織），檢測(cè)其組織中REDD1 蛋白、mRNA 表達(dá)水平。 本研究的倫理批準(zhǔn)由江西腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)提供。

1.1.2 細(xì)胞及主要試劑 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231 細(xì)胞由江西省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清等購(gòu)自ThermoFisher 公司。 兔抗人REDD1 單克隆抗體、 兔抗人PI3K 單克隆抗體、 兔抗人AKT 及pAKT 單克隆抗體、 兔抗人Caspase3 單克隆抗體、兔抗人Bcl-xl 抗體、 兔抗人β-actin 及HRP 偶聯(lián)的抗兔IgG 二抗均購(gòu)自CellSignaling 公司。 RNA提取及RT-qPCR 試劑盒購(gòu)自ThermoFisher 公司。siRNA 及Hiperfect 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自ThermoFisher 公司。 Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒購(gòu)自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM, 于37℃含5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋70%-80%瓶底面積時(shí)，用于實(shí)驗(yàn)操作或傳代。

1.2.2 siRNA 轉(zhuǎn)染 將MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞按5×104/孔的密度分別接種于6 孔板中，待細(xì)胞融合度為30%-50%時(shí)， 使用Hiperfect 轉(zhuǎn)染試劑，分別轉(zhuǎn)染siRNA- REDD1/NC， 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.3 Western-blot 提取各處理組蛋白，等量蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳后， 穩(wěn)流將蛋白轉(zhuǎn)至甲醇預(yù)處理的PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜、封閉后按流程分別加入一抗(1:1000) 和二抗(1:5000)。 于MYECL Imager系統(tǒng)曝光。

1.2.4 RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR (RT-qPCR)總RNA 提取使用TRIzol， 逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增反應(yīng)采用RT-qPCR 試劑盒（SYBR Green）。 逆轉(zhuǎn)錄(20μl 體系)：42℃1h, 95℃10min。 qPCR (10μl 體系)：95℃3min，95℃15s，60℃30s，再循環(huán)擴(kuò)增39 次。 基因相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCq 計(jì)算方法。 引物序列如下:

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各處理組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，Cell Staining Buffer 洗2 次，加入100μl Binding Buffer、5μl Annexin V-FITC、10ul PI, 室溫避光30min， 檢測(cè)前加入400μl Binding Buffer，1h 內(nèi)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 每組設(shè)3 孔平行樣。 使用FlowJo 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 REDD1 在乳腺癌組織中高表達(dá) 在25 對(duì)乳腺癌及其癌旁組織，RT-qPCR 結(jié)果提示REDD1 mRNA 在乳腺癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(圖1A)。 在5 對(duì)乳腺癌（T）及其癌旁正常組織（N），Western-blot 結(jié)果顯示REDD1 蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織(圖1B)。

圖1 REDD1 在乳腺癌組織中過(guò)表達(dá)。（A）RT-qPCR 檢測(cè)25 例乳腺癌組織及其癌旁正常組織中REDD1 mRNA 表達(dá)水平。（B）Western-blot 檢測(cè)5 例乳腺癌組織及其癌旁正常組織中REDD1蛋白表達(dá)水平

2.2 siRNA-REDD1 成功下調(diào)REDD1 表達(dá)水平為了進(jìn)一步探索REDD1 生物學(xué)功能， 我們使用siRNA-REDD1/NC 轉(zhuǎn)染MCF-7 和MDA-MB-231細(xì)胞，siRNA-REDD1 成功下調(diào)REDD1 蛋白及mRNA 表達(dá)水平(圖2A&B)。

圖 2 MCF-7 和 MDA-MB-231 細(xì) 胞 分 別 轉(zhuǎn) 染siRNA-REDD1/NC。（A）RT-qPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后REDD1 mRNA表達(dá)水平（B）Western-blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后REDD1 蛋白表達(dá)水平

2.3 下調(diào)REDD1 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡 使用siRNA-REDD1/NC 分別轉(zhuǎn)染MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞后， 流式AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率（±s）。 結(jié)果顯示(圖3A)，MCF-7 細(xì)胞中對(duì)照組（REDD1-NC）凋亡率為(16.5±5.08)%，而REDD1 下調(diào)組凋亡率明顯升高，為(29±2.08)%；同樣，在MDA-MB-231 細(xì)胞中，對(duì)照組凋亡率為(17.4±1.38)%，而REDD1 下調(diào)組凋亡率(36.7±1.25)%。同時(shí)，我們檢測(cè)了凋亡蛋白cleaved caspase3(斷裂caspase3)和凋亡抑制蛋白Bcl-xl 表達(dá)水平，結(jié)果顯示（圖3B），REDD1 下調(diào)組抗凋亡蛋白BCL-xl 下降，cleaved-capase3 上升。

圖 3 MCF-7 和 MDA-MB-231 細(xì) 胞 分 別 轉(zhuǎn) 染siRNA-REDD1/NC。（A）AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。（B）Western-blot 檢測(cè)MCF-7 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3 和BCL-xl

2.4 下調(diào)REDD1 抑制PI3K/AKT 通路蛋白表達(dá)水平 為了探討下調(diào)REDD1 促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子作用機(jī)制，使用siRNA-REDD1/NC 轉(zhuǎn)染MCF-7 細(xì)胞后行western-blot 檢測(cè)PI3K、AKT、pAKT 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，siREDD1 組PI3K、pAKT 蛋白表達(dá)水平低于NC 組，AKT 蛋白表達(dá)無(wú)差異。 提示下調(diào)REDD1 可抑制PI3K/AKT 通路磷酸化激活(圖4)。

圖4 MCF-7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-REDD1/NC，Western-blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白PI3K/AKT 通路蛋白表達(dá)

3 討論

DNA 損傷反應(yīng)調(diào)節(jié)基因1 ( regulated in DNA damage and development 1，REDD1 )是Shoshani 等在研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞乏氧時(shí)發(fā)現(xiàn)的、 因細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)表達(dá)的一種基因。 在人體正常組織中，REDD1 廣泛低表達(dá)， 然而在腫瘤組織中，REDD1常呈現(xiàn)高表達(dá)，REDD1 高表達(dá)有助于幫助腫瘤細(xì)胞在組織乏氧、能量壓力、DNA 損害等的不良環(huán)境中存活[12]。 然而，REDD1 在腫瘤中可兼具抑癌、促癌功能， 表現(xiàn)在不同腫瘤、 不同環(huán)境中的功能不同。 研究表明REDD1 過(guò)表達(dá)可介導(dǎo)PI3K/AKT 促進(jìn)前列腺細(xì)胞凋亡抵抗[10]，而另有研究卻顯示乏氧狀態(tài)可誘導(dǎo)REDD1 高表達(dá)、抑制mTOR，抑制前列腺癌細(xì)胞增殖[13]。 在卵巢癌中，REDD1 是ras 介導(dǎo)的人卵巢上皮是細(xì)胞癌變轉(zhuǎn)化的重要因子，REDD1 高表達(dá)可促進(jìn)卵巢上皮細(xì)胞增殖、 抑制細(xì)胞凋亡[12,14]。 沉默REDD1 可抑制細(xì)胞自噬提高膀胱癌化療敏感性[15]。 然而，在乳腺癌中的作用及機(jī)制尚不明確。

本研究首先檢測(cè)了乳腺癌組織及癌旁組織中REDD1 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中REED1 在基因及蛋白水平上均明顯高于癌旁正常組織， 提示REDD1 在乳腺癌中的作用可能為癌基因, 與孫麗麗等在卵巢癌中的研究結(jié)果一致[16]。進(jìn)一步功能學(xué)研究顯示，使用siRNA 下調(diào)REDD1 表達(dá)后，乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡率明顯升高，凋亡蛋白cleaved-caspase3 升高，而凋亡抑制蛋白Bcl-xl 下降，抑制REDD1 表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，提示REDD1 可能參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞凋亡途徑。 然而，本研究未構(gòu)建REDD1 過(guò)表達(dá)模型，具有一定的局限性，后續(xù)研究將進(jìn)一步完善。

在乳腺癌中，P13K/AKT 信號(hào)通路激活與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等惡性表型密切相關(guān)。癌基因過(guò)表達(dá)或抑癌基因突變均可上調(diào)PI3K/AKT通路表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞惡性表型[17-20]，PI3K 抑制劑LY294002 可顯著性下調(diào)PI3K/AKT 通路從而抑制乳腺癌生長(zhǎng)[21-23]。 本研究結(jié)果顯示,下調(diào)RED D1 表達(dá)可抑制PI3K/AKT 通路磷酸化激活， 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡， 說(shuō)明REDD1/PI3K/AKT 是調(diào)控乳腺癌細(xì)胞凋亡途徑的通路之一，但PI3K/AKT 通路是否為REDD1 主要的分子調(diào)控通路，還需要進(jìn)行阻斷-恢復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證。

綜上，REDD1 在乳腺癌中高表達(dá)， REDD1 介導(dǎo)PI3K/AKT 通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞凋亡途徑，REDD1 可能為乳腺癌潛在新的靶基因。