枸杞多糖在AP小鼠體內抗炎、抗氧化應激的作用機制

唐開鋒 王劍虹 余家奇

(遵義市第一人民醫(yī)院 1藥劑科，貴州 遵義 563000；2質量管理辦公室)

急性胰腺炎(AP)為臨床上常見的急腹癥之一，且為消化科住院患者的主要病因〔1〕。AP患者的病死率為5%～10%，若AP患者得不到及時干預會很快發(fā)展為急性重癥胰腺炎(SAP)，出現(xiàn)多臟器損傷和功能衰竭，死亡率高達30%〔2〕。隨著對AP療效研究的不斷深入，目前在西藥的常規(guī)治療基礎上聯(lián)合中藥治療可提高治療效果，減少并發(fā)癥。

枸杞多糖(LBP)是一種從植物枸杞子中提取的水溶性多糖，為枸杞中的主要活性成分〔3〕，為多糖和蛋白聚糖的混合物〔4〕，具有抗腫瘤、抗衰老、抗應激、保肝、保護神經、降血脂、雙向調節(jié)血糖、增強免疫的功效，更顯著的為抗炎、抗氧化作用，其能有效抑制與慢性炎癥相關的損傷〔5〕。LBP在糖尿病〔6，7〕、結腸癌〔8〕、神經膠質損傷〔9，10〕、視網(wǎng)膜損傷〔11〕、卵巢上皮血管損傷〔12〕、腎癌〔13〕、肝癌及肝損傷〔14～16〕和膀胱癌〔17〕中均具有保護作用。但LBP在AP中的功能尚未完全清楚。

炎性介質的釋放失控造成機體免疫調節(jié)網(wǎng)絡的紊亂，機體抗炎因子與促炎因子的分泌失衡，有可能會導致全身性炎癥反應綜合征〔18〕。其中與AP相關的保護性炎癥介質有白細胞介素(IL)-10、IL-2、可溶性腫瘤壞死因子受體(STNFR)、IL-1ra、前列環(huán)素(PGI)2和一氧化氮(NO)等。NF-κB 信號通路能調節(jié)生長因子、轉錄因子、細胞素、趨化因子等內在基因的轉錄，參與炎癥、細胞凋亡、免疫反應等病理過程，其與炎癥性疾病關系密切〔19〕。AP發(fā)病早期炎癥反應的主要病因是胰腺腺泡細胞內酶源被異常激活，大量的細胞因子IL-6、IL-2、IL-β和TNF-α也被激活，其在AP發(fā)生發(fā)展中具有重要作用〔20，21〕。氧化應激是機體氧化和抗氧化作用失衡，導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物。氧化應激為急性胰腺炎發(fā)病機制中的中藥調節(jié)器〔22，23〕。氧自由基(OFR)和促炎因子的作用在AP發(fā)病機制中均具有重要作用〔24〕。大量研究證實，LBP具有抗炎、抗氧化應激作用及炎癥和氧化應激在AP中的重要作用〔9，13，21，25〕。但LBP在AP中對炎癥和氧化應激的作用機制尚未研究。本研究擬用LBP治療AP模型小鼠，分析血清中炎性因子的含量和胰腺組織中氧自由基相關指標的變化及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性昆明鼠54只，18～20 g，購自上海凱學生物科技有限公司。

1.2主要藥物、試劑和儀器 LBP購自西安森冉生物工程有限公司；雨蛙素、脂多糖(LPS)購自北京寶奧萊博公司；髓過氧化物酶(MPO)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自南京建成研究所；雨蛙素購自Sigma公司；炎性因子IL-6、IL-β、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒購自康為世紀；MDA競爭酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自加拿大ELIXIR公司；MPO夾心ELISA試劑盒、SOD ELISA檢測試劑盒購自美國Bioxytech；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒均購自大連Takara公司；半干轉膜儀購自美國BIO-RAD公司；ABI 7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國ABI公司；紫外分光光度計購自美國Thermo公司。

1.3AP模型的建立 將54只小鼠隨機分成3組，每組18只，分別為對照組(滅菌生理鹽水)，AP組(雨蛙素聯(lián)合脂多糖)和LBP組(雨蛙素聯(lián)合LPS+LBP)。造模前12 h小鼠禁水不禁食。雨蛙素為1 mg/ml，每次間隔1 h，連續(xù)給藥6次，最后一次另給藥后再給藥10 mg/ml LPS，即完成造模。治療組在造模結束0 h和4 h腹腔注射5 mg/ml LBP。

1.4胰腺系數(shù) 將對照組、AP組和LBP組小鼠稱重，眼球采血，斷頸法處死，摘取完整的胰腺組織并稱重。胰腺系數(shù)=胰腺濕重(mg)/小鼠體重(g)。

1.5胰腺組織病理評分 運用Rongione病例評分標準對對照組、AP組和LBP組小鼠胰腺組織的病理變化進行評分。光鏡下觀察3組胰腺：胰腺的體積、邊界；腺小葉的結構形態(tài)、中性粒細胞和紅細胞的浸潤、水腫；腺泡的輪廓，結構的完整度，胞核胞仁的著色；是否有出血壞死病變等進行綜合評價。

1.6ELISA 用ELISA試劑盒測定小鼠血清中IL-6、IL-β、TNF-α的含量。采用競爭性抑制ELISA試劑盒檢測MDA；夾心ELISA試劑盒檢測MPO；ELISA試劑盒檢測SOD。

1.7qRT-PCR 用無菌生理鹽水研磨胰腺組織，用RNA抽提試劑盒提取總RNA，微量分光光度計進行RNA定量后，用逆轉錄試劑盒合成cDNA。最后按照qRT-PCR試劑盒說明書操作，檢測樣品中p65 mRNA的表達，用2-△△Ct計算p65的相對表達水平，每個樣品重復檢測3次。

1.8Western印跡 用無菌生理鹽水研磨胰腺組織，低溫離心后提取細胞核蛋白，BCA法進行定量。按照Western印跡實驗常規(guī)操作流程進行電泳-轉膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-顯影曝光。Image J分析目的條帶灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示p65蛋白的表達。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組胰腺系數(shù)比較 AP組胰腺系數(shù)(11.49±0.83)顯著高于對照組(5.83±0.16)，LBP組(8.12±0.47)顯著低于AP組，3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=77.993，P=0.000)。

2.2各組胰腺組織損傷情況比較 AP組胰腺組織病例評分〔(6.53±0.73)分〕顯著高于對照組〔(0.22±0.04)分〕，LBP組〔(5.16±0.45)分〕顯著低于AP組，3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=134.525,P=0.000)。

2.3各組炎性因子表達比較 AP組IL-6、IL-β、TNF-α水平顯著高于對照組，LBP組顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組IL-6、IL-β、TNF-α水平比較

2.4LBP對小鼠體內氧化應激的影響 AP組MDA、MPO水平顯著高于對照組，LBP組顯著低于AP組(P<0.05)；AP組SOD水平顯著低于對照組，LBP組顯著高于AP組(P<0.05)。見表2。

表2 各組MDA、SOD、MPO水平比較

2.5LBP對NF-κB信號通路的影響 AP組p65 mRNA、p65蛋白表達(1.83±0.15，0.76±0.06)顯著高于對照組(1.01±0.08，0.38±0.04；P<0.05)，LBP組(1.19±0.10，0.57±0.05)顯著低于AP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 LBP對NF-κB信號通路的影響

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學認為AP是暴飲暴食、酗酒、高鈣血癥、高脂血癥、感染和某些藥物引起的膽汁胰液逆流，激活胰酶使胰管壓力增高，部分胰管破裂，進而胰液滲入胰間質導致胰腺的自我消化，其在AP的治療上以抑制胰腺的分泌功能為主。傳統(tǒng)醫(yī)學認為AP的發(fā)生多由六淫之邪、飲食不節(jié)、情志失暢、創(chuàng)傷等引起肝郁氣滯、肝膽濕熱、胃腸熱結，其在治療上以通導為主〔25〕。目前，臨床上多采用中西醫(yī)結合的方法治療胰腺炎。

枸杞子為我國傳統(tǒng)的名貴中藥材?！侗静菥V目》記載“枸杞，補腎生精，養(yǎng)肝，明目，堅精骨，去疲勞，易顏色，變白，明目安神，令人長壽”，故有“紅寶”之稱〔26〕。枸杞子富含LBP、甜菜堿、氨基酸、胡蘿卜素、維生素B、維生素C、鈣、磷、鐵等多種營養(yǎng)成分，具有很高的營養(yǎng)價值。LBP為枸杞子的主要活性成分，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和鼠李糖6種單糖組成，含有多種微量元素和氨基酸的蛋白雜多糖〔27〕。王建東等〔28〕以灘羊為研究對象，用LBP飼喂灘羊發(fā)現(xiàn)，LBP可提高灘羊抗體水平和細胞因子的分泌；王曉麗等〔29〕在子宮內膜上皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，LBP能抑制過氧化氫誘導的子宮內膜上皮細胞的損傷，對子宮內膜上皮細胞具有保護作用。大量研究顯示，LBP對多種疾病損傷和腫瘤均具有保護作用〔26～29〕。本研究結果顯示，LBP對雨蛙素聯(lián)合LPS誘導小鼠胰腺損傷具有保護作用。

NF-κB為一種可以調控炎癥反應的重要轉錄因子。NF-κB被活化后進入細胞核內，對炎性因子TNFα、IL-1β、IL-6和iNOS等炎癥基因進行表達〔30〕。Jin等〔31〕研究報道，LBP可抑制NF-κB通路，下調促炎介質和趨化因子，緩解肝臟炎癥，阻斷NF-κB通路可抑制炎癥反應；LBP可通過抑制血清中炎性介質IL-6、IL-1、TNF-α表達，減輕腦缺血導致的腦病理組織損傷及神經功能障礙〔32〕；有研究報道，AP患者血漿中LPO、MPO含量升高，SOD活性降低〔33〕；韓麗娜等〔34〕研究揭示LBP保護AP小鼠胰腺損傷的作用機制。

綜上，LBP可保護AP小鼠胰腺損傷，其機制可能與抗炎、抗氧化應激有關，將為LBP用于胰腺炎的臨床治療提供實驗依據(jù)。