阿爾茨海默病小鼠海馬組織差異表達(dá)miRNA-687的生物信息學(xué)分析

吳俊 張穎

(江蘇省疾病預(yù)防控制中心毒理與風(fēng)險(xiǎn)評估研究所，江蘇 南京 210009)

阿爾茨海默病(AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙、記憶力損害和精神行為異常為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變〔1〕。我國的人口老齡化導(dǎo)致AD患者數(shù)目增長迅速，我國每7 s就有一個(gè)人患上AD，平均生存期僅有5.9年〔2〕。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不明確，文獻(xiàn)報(bào)道，包括β-淀粉樣蛋白假說、“Tau蛋白”假說在內(nèi)的多種機(jī)制研究〔3,4〕。MicroRNA是一類長度為19～25個(gè)核苷酸的小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)microRNA與AD的發(fā)生和發(fā)展有密切聯(lián)系，microRNA可能通過直接或間接調(diào)節(jié)β-淀粉樣蛋白代謝、軸突可塑性等方式參與其中〔5,6〕。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展如基因芯片等，為全面研究AD發(fā)生的分子機(jī)制提供了新手段。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析AD模型小鼠海馬組織差異表達(dá)的相關(guān)microRNA，并以其中一個(gè)microRNA為靶點(diǎn)，挖掘其可能參與的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步闡明AD發(fā)生的分子機(jī)制提供新的研究線索。

1 材料與方法

1.1材料 從美國國立生物技術(shù)信號中心(NCBI)公共數(shù)據(jù)平臺GEO檢索“Alzheimer′s disease〔All Fields〕AND microRNA〔All Fields〕AND Hippocampus〔All Fields〕”，選擇物種為小鼠，并下載基因芯片數(shù)據(jù)集GSE48028。GSE48028包含來源于6只AD模型小鼠和6只對照小鼠雙側(cè)海馬組織標(biāo)本差異表達(dá)的microRNA信息。

1.2microRNA篩選及數(shù)據(jù)處理 使用GEO2R在線工具分析和查找差異表達(dá)的microRNA，以|Log FC|>1.5和P<0.05對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3靶基因預(yù)測 采用TargetScan7.2靶基因預(yù)測工具和miRDB在線靶基因預(yù)測網(wǎng)站，選擇物種為小鼠，輸入miRNA-687運(yùn)行后導(dǎo)出該microRNA的靶基因預(yù)測結(jié)果，并把2個(gè)靶基因預(yù)測工具預(yù)測出的靶基因取交集。

1.4富集分析(GO)和通路分析(KEGG) DAVID是一個(gè)在線生物信息數(shù)據(jù)庫，其中GO用于注釋基因生物學(xué)過程，KEGG用于預(yù)測其相關(guān)信號通路。利用DAVID數(shù)據(jù)庫，以小鼠基因組數(shù)據(jù)為背景，從生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3方面富集并分析上述預(yù)測得到的靶基因，并利用KEGG功能進(jìn)行分析。應(yīng)用R軟件3.5.3版對分析結(jié)果進(jìn)行整理。

1.5靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測將miRNA-687的靶基因?qū)隨TRING在線分析網(wǎng)站，設(shè)置可信度為0.4則認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，得出其靶基因編碼蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。Cytoscape3.7.1軟件用于可視化分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)內(nèi)靶基因編碼蛋白的連通度。以degree cutoff =2，node score cutoff =0.2，k-core =2，max.Depth=100為標(biāo)準(zhǔn)，利用Cytoscape內(nèi)的MCODE插件對互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行評分，得出評分表較高的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，找出關(guān)鍵靶基因。使用在線Uniprot數(shù)據(jù)庫對互作節(jié)點(diǎn)度≥4的靶基因進(jìn)行功能分析。

2 結(jié) 果

2.1篩選出差異表達(dá)的microRNA 計(jì)算模型組和對照組樣本間|Log FC|和P值，篩選出下調(diào)microRNA共8個(gè)：miRNA-693-5p、miRNA-707、miRNA-679、miRNA-878-3p、miRNA-701、miRNA-465c-5p、miRNA-878-5p、miRNA-687，上調(diào)microRNA共4個(gè)：miRNA-376a、miRNA-362-3p、miRNA-455、miRNA-883a-5p，見表1。

表1 差異表達(dá)的microRNA篩選結(jié)果

2.2miRNA-687的靶基因預(yù)測 miRNA-687被認(rèn)為是腎缺血再灌注損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和治療靶點(diǎn)，但對其在神經(jīng)系統(tǒng)方向及更為深入的相關(guān)機(jī)制和功能研究報(bào)道很少，本文選擇miRNA-687作為研究對象預(yù)測其靶基因，為進(jìn)一步研究miRNA-687的機(jī)制和功能提供線索。利用TargetScan靶基因預(yù)測工具發(fā)現(xiàn)miRNA-687的靶基因2 137個(gè)，miRBase在線預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測靶基因230個(gè)，對2種工具預(yù)測出的靶基因取交集得到172個(gè)共同的靶基因，Peg10，Sos2，Atp11c，Irx2，Paqr8，Pde3b，Homer1，Cpeb3，Usp53，Hormad2，Dcaf12l2，Vps26b，Slc24a2，Cyp7b1，Suds3，Plekho1，Slc2a4，Met，Ninj2，Sstr1，Adam10，Mycbp2，Sfrp4，Ascl2，Dennd5b，Scarb2，Klf12，Exph5，Ptpn12，Crls1，Cherp，Dld Prr7，span2，Rasl11b，P2ry13，F(xiàn)lvcr2，Six3，Iqsec1，Vax1，Nufip2，Naa15，Tbx20，Pus1，F(xiàn)am168b，Riok3，St8sia4，F(xiàn)bxo28，Htr7，Pten，Prmt3，Luzp1，Clock，Itln1，F(xiàn)uca2，Pex5l，Sept7，Kif2a，Ankrd9，F(xiàn)gfbp1，Nid1，Ccser1，F(xiàn)ut9，Cdh6，B3gat1，Tmtc4，Plxnb1，Map3k1，Rnf138，Nfya，Ppm1e，L2hgdh，Ywhaz，Cxadr，Nol4，Vps28，Dido1，F(xiàn)am84b，Tmed7，Twistnb，Gfm1，Tmx1，Srsf10，Sgpp2，Igsf1，Gpc6，Tnfsf4，Krtap26-1，Rassf5，Lrba，Tlk1，Pias2，Chic1，Cebpg，Tram1l1，Msl2，Kcnd3，Abi1，Atxn1l，Tapt1，Eva1a，Six1，Ctxn3，Ptges3，Aspn，Gm2a，Zkscan8，Clic5，Slc30a9，Pdcd6ip，Prkca，Bcar3，Mak16，Ubox5，Maml2，Nrl，Amacr，Ldha，Nlrc5，Was，Anxa3，Ska3，Grip1，F(xiàn)icd，Pcyox1，Syap1，Nr4a3，Srgn，Sin3a，Tm2d2，Dennd6a，Ranbp3l，Rp1，Mars2，F(xiàn)gf20，Cadm2，Arhgef38，Clec7a，Insr，Pank3，Gtf2a1，Bag4，Col19a1，Camk4，Vps33b，Tmx4，Mtcp1，Megf9，Gpr161，Rap2c，Igfbp4，Tdrd6，Tctex1d1，Sdhd，Zscan22，Rrm2b，Itga4，Slain2，Ppp1r16b，4-Mar，Rarb，F(xiàn)ance，Itgb1bp2，Tmem130，Metap2，Serpinb8，Nfib，Mthfr，Stk3，Sp1，Trpm3，Arfgef1，Rora。

2.3miRNA-687靶基因的GO和KEGG 通過GO靶基因的主要生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞組件，整理了排名前十位且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其們主要參與了RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程、樹突棘形態(tài)發(fā)生、DNA轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過程；分子功能包括蛋白結(jié)合作用、核心啟動子序列特異性DNA結(jié)合、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性、調(diào)節(jié)鳥苷核苷酸交換因子活性等功能；而細(xì)胞組成分析顯示這些基因大多集中在投射神經(jīng)元、再循環(huán)內(nèi)體、突觸等區(qū)域。見圖1。

圖1 miRNA-687靶基因的GO

KEGG結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號通路包括：(1)PI3K-Akt信號通路(mmu04151)，該通路由9個(gè)miRNA-687的靶基因參與，分別為Prkca、Ywhaz、Sos2、Met、Mtcp1、Itga4、Fgf20、Pten、Insr。(2)非小細(xì)胞肺癌(mmu05223)，該通路由4個(gè)靶基因參與，分別為Prkca、Rassf5、Sos2、Rarb。(3)Ras信號通路(mmu04014)，該通路由7個(gè)靶基因參與，分別為Prkca、Rassf5、Htr7、Sos2、Met、Fgf20、Insr。(4)FoxO信號通路(mmu04068)，該通路由5個(gè)靶基因參與，分別為Slc2a4、Sos2、Homer1、Pten、Insr。

2.4miRNA-687靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 利用STRING數(shù)據(jù)庫分析得到網(wǎng)絡(luò)關(guān)系如，顯示172個(gè)節(jié)點(diǎn)之間存在82種關(guān)系，其中Suds3與Sin3a、Abi1與Was、Clock與Rora、Mak16與Twistnb、Fuca2與Gm2a、Met與Plxnb1、Grip1與Prkca、Gtf2a1與Sp1、Adam10與Rap2c、B3gat1與Gpc6這十對基因之間的聯(lián)系最為密切。插件MCODE分析后發(fā)現(xiàn)符合參數(shù)要求的有3個(gè)子模塊，第1、2個(gè)子模塊分別由4個(gè)節(jié)點(diǎn)和6條邊組成，第3個(gè)子模塊由3個(gè)節(jié)點(diǎn)和3條邊組成，Pten、Met、Insr、Ptpn12、Fuca2、Eva1a、Adam10、Igfbp4這8個(gè)靶基因在蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，是受miRNA-687調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因。

3 討 論

AD是老年人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以β-淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑、tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)及大量神經(jīng)元死亡為病理特征?，F(xiàn)已明確，microRNA可與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)特異性結(jié)合，負(fù)向調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程〔7〕。基因調(diào)控與AD的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。研究顯示microRNA與β-淀粉樣蛋白致AD的機(jī)制有關(guān)，如在AD小鼠模型中，上調(diào)的miR-331-3p可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)引起β-淀粉樣蛋白升高〔8〕。此外，microRNA與tau蛋白的磷酸化密切相關(guān)，Dickson等〔9〕發(fā)現(xiàn)晚期AD患者富集tau蛋白的腦組織中miRNA-512的表達(dá)降低，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miRNA-512通過靶向細(xì)胞型Fas相關(guān)死亡區(qū)域的β白細(xì)胞介素(IL)-1轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白從而負(fù)調(diào)控tau蛋白表達(dá)。

miRNA-687位于小鼠的第14號染色體上，關(guān)于miRNA-687的研究主要集中于急性腎損傷方面〔10〕。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA-687在腎缺血再灌注小鼠腎臟組織和缺氧狀態(tài)下的腎臟細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)〔11〕。miRNA-687抑制了磷酸酶張力蛋白同系物基因Pten的表達(dá)從而促進(jìn)了細(xì)胞周期進(jìn)展和凋亡。而其在神經(jīng)系統(tǒng)方面及更為深入的相關(guān)機(jī)制和功能研究報(bào)道很少，通過靶基因預(yù)測、GO、KEGG，更好地探討miRNA-687的分子機(jī)制和生物學(xué)功能。綜合GO結(jié)果可以推測，miRNA-687可能通過調(diào)控集中于投射神經(jīng)元、再循環(huán)內(nèi)體、突觸等區(qū)域的靶基因調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄、參與細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)樹突棘形態(tài)發(fā)生等生物學(xué)過程影響AD的發(fā)生發(fā)展。KEGG提示miRNA-687靶基因集中于PI3K-Akt、Ras等信號通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與AD患者神經(jīng)元死亡有關(guān)，而Pten抑制劑可以通過激活A(yù)PP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的PI3K/AKT信號通路來抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而起到神經(jīng)保護(hù)作用〔12〕。此外，淀粉樣前體蛋白可激活Ras信號通路從而促進(jìn)了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生〔13〕。

STRING在線分析網(wǎng)站和Cytoscape軟件預(yù)測Pten、Met、Insr、Ptpn12、Fuca2、Eva1a、Adam10、Igfbp4這8個(gè)靶基因受miRNA-687調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因。磷酸酶及張力蛋白同源基因Pten定位于染色體10q23.3，由9個(gè)外顯子組成，編碼由403個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，具有磷酸酯酶活性。除上述Pten抑制劑通過PI3K/AKT信號通路來抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激外，Pten能有效避免AD模型中突觸功能失常和認(rèn)知功能缺陷〔14〕。Met是受體型酪氨酸激酶RTK家族成員之一，其配體為間質(zhì)起源的細(xì)胞產(chǎn)生的肝細(xì)胞生長因子Hgf，二者結(jié)合組成Met/Hgf信號系統(tǒng)參與葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖、神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生〔15〕，在AD患者腦組織海馬神經(jīng)元中Met的表達(dá)呈下降趨勢，這種下降可能對AD患者神經(jīng)元的存活產(chǎn)生不利影響。AD的主要病理特征包括腦內(nèi)毒性β-淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)元大量消失死亡。而β-淀粉樣蛋白是由淀粉樣前體蛋白APP 降解而來。Adam10屬于Ⅰ類單個(gè)跨膜蛋白，促進(jìn)其向細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)及過表達(dá)能夠加強(qiáng)對APP的降解。臨床上細(xì)胞α分泌酶可用于治療AD患者，而Adam10不僅可以作為主要的α分泌酶，還可以通過與底物的相互作用影響Tau蛋白、突觸功能、海馬神經(jīng)發(fā)生和膠質(zhì)生成〔16〕。上述研究均為miRNA-687及受其調(diào)節(jié)的靶基因作為AD研究的新靶點(diǎn)提供了線索，但仍有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上，本研究通過應(yīng)用生物信息學(xué)方法對GEO數(shù)據(jù)庫中AD小鼠海馬組織差異表達(dá)的microRNA數(shù)據(jù)集進(jìn)行挖掘，成功篩選了12個(gè)差異表達(dá)microRNA，對其中研究較少的miRNA-687進(jìn)行靶基因預(yù)測后，對這些靶基因進(jìn)行GO和KEGG，初步明確了其功能和相關(guān)的信號通路。此外，通過構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，從中選出了8個(gè)受miRNA-687調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步研究miRNA-687及其他差異表達(dá)的microRNA參與調(diào)節(jié)AD發(fā)生的機(jī)制研究提供了新靶點(diǎn)。