高尿酸勃起功能障礙大鼠模型的建立

葛平玉 郭銀雪 常青 吳棲岸

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1泌尿外科， 貴州 貴陽 550001；2腎內(nèi)科)

勃起功能障礙(ED)為陰莖無法勃起，或勃起持續(xù)時間不長的一種生理現(xiàn)象，無法完成滿意的性生活〔1〕。預(yù)計到2025年，在世界范圍內(nèi)，將存在3.22億男性受ED困擾〔2〕。通常情況下，導(dǎo)致ED的因素較為復(fù)雜且繁多，比如高血壓、糖尿病及腎衰竭等。有研究表明：ED的出現(xiàn)受機(jī)體高尿酸(UA)水平的影響〔3〕，研究還指出，近幾年我國高尿酸血癥的發(fā)病率逐漸提高，可達(dá)13%～25%〔4〕。本文建立并評價高UA ED大鼠模型，為不同目的要求的研究提供建模參考。

1 材料與方法

1.1動物 仔細(xì)篩選120只SPF級SD雄性大鼠，生長周期8～10 w，體重180～220 g，全部從貴州醫(yī)科大學(xué)購入。許可證號：SCXK(黔)2015-0001。

1.2試藥 酵母干粉(廠商：廣州天馬化工公司，產(chǎn)品批號：120206-03)；阿撲嗎啡(APO，廠商：美國Sigma-Aldrich公司)；UA試劑(產(chǎn)品批號：20160606)，尿素氮(BUN，產(chǎn)品批號：20160518)，肌酐(Cr，產(chǎn)品批號：20160606)，以上試劑廠商：南京建成生物技術(shù)有限公司；氧嗪酸鉀鹽(廠商：北京Solarbio公司，產(chǎn)品批號：20160625)；鹽酸乙胺丁醇片(廠商：湖北宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號：H42022126)。

1.3儀器 16通道的生理記錄儀、刺激電極：選用美國Biopac公司所制造的MP150型多導(dǎo)電記錄儀；生化分析儀：美國貝克曼庫爾特(Beckman Coulter)AU680全自動生化分析儀；離心機(jī):四川蜀科儀器有限公司LG-21M型離心機(jī)；電子分析天平：南通瑞科實驗儀器有限公司；手術(shù)解剖顯微鏡：中科院光電技術(shù)研究所(四川成都)ASQM-4型。

1.4藥物配置 飼料制作：常規(guī)飼料打粉后摻入酵母粉(15 g/kg)混勻，壓制成圓柱狀飼料。乙胺丁醇懸液：將藥片碾碎成粉末狀，加入消毒蒸餾水進(jìn)行溶解，確保充分混合均勻，進(jìn)而得到25 ng/ml的溶液備用。氧嗪酸鉀鹽的制備：先將此藥物碾碎成細(xì)粉末狀，再添加一定量的羧甲基纖維素鈉溶液，充分混勻制成氧嗪酸鉀混懸液備用。

1.5動物分組與處理 仔細(xì)篩選120只SPF級的SD雄性大鼠，自由進(jìn)行編號，使用上述飼料適應(yīng)飼養(yǎng)1 w，隨機(jī)進(jìn)行選取分為：空白對照組、模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組。其中對后4組大鼠分別花費4 w、8 w、12 w及16 w的時間來進(jìn)行造模。各模型組按酵母粉(15 g/kg)飼料喂養(yǎng)，乙胺丁醇懸液(250 mg/kg)灌胃，氧嗪酸鉀(200 mg/kg)皮下注射造模〔5〕。

1.6UA、BUN及Cr的測定 大鼠尾靜脈處取血，4 000 r/min離心15 min，得到血清。采用AMS-18型自動分析儀測定UA、BUN、Cr的含量水平。

1.7高UA ED大鼠的篩選 各組模型大鼠造模最后1 d，昏暗光照下置入觀察籠中，適應(yīng)環(huán)境10 min后，皮下注射APO溶液(100 μg/kg),密切觀察30 min。APO(+)高尿酸血癥的大鼠而言，主要特征是陰莖露出；如若不然，則為高UA ED大鼠，也就是所說的APO(-)高尿酸血癥大鼠。

1.8大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓(ICP)測定〔6～8〕基于35 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)向大鼠腹腔內(nèi)注射 0.4%戊巴比妥鈉，確保大鼠處于徹底麻醉狀態(tài)，若大鼠角膜反射喪失，則表示麻醉效果優(yōu)良。借助醫(yī)學(xué)解剖顯微鏡，充分暴露游離頸總動脈1.5 cm，過程中務(wù)必確保不要損傷周圍的迷走神經(jīng)。無損傷血管夾暫時夾閉頸總動脈，做“V”字切口剪開頸總動脈，迅速置入PE50管并近心端結(jié)扎固定，肝素封管后與三通管及MP150型多導(dǎo)電生理記錄儀連接備用。從腹部正中位置切口進(jìn)入，找到前列腺后外側(cè)盆腔神經(jīng)節(jié)與陰莖海綿體神經(jīng)，完全展現(xiàn)出陰莖海綿體組織。25G輸液針注入肝素，接入三通管，迅速連接MP150型多導(dǎo)電生理記錄儀，借助顯微鏡，慢慢把針頭插入陰莖海綿體內(nèi)，保持通暢。再將刺激電極接入陰莖海綿體的神經(jīng)上，其中參數(shù)設(shè)置成15 Hz、1.2 ms，分別在2.5 V，5.0 V，7.5 V條件下依次刺激1 min，且每次刺激間隔10 min。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行t檢驗、非參數(shù)秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組UA、BUN及Cr含量比較 各模型組UA水平顯著高于空白對照組(P<0.05)。而模型Ⅳ組BUN、Cr水平顯著上升，相比于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對比模型Ⅲ、Ⅳ組大鼠的血尿酸水平，差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組UA、BUN、Cr比較

2.2各組ICP/平均動脈壓(MAP)比較 模型Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組APO(-)大鼠ICP/MAP值都呈現(xiàn)出顯著下降態(tài)勢，顯著低于空白對照組(P<0.05)；模型Ⅲ、Ⅳ組APO(+)大鼠ICP/MAP值顯著低于空白對照組(P<0.05)。模型Ⅳ組、Ⅲ組APO(-)、APO(+)大鼠ICP/MAP值均顯著低于模型Ⅱ組(P<0.05)。見表2。

表2 各組不同電刺激下ICP/MAP比較

3 討 論

要想構(gòu)建出一個高度仿真的高UA ED分析模型，務(wù)必確保血UA的穩(wěn)定及維持〔9〕。連續(xù)給予造模劑可使受試動物血UA值持續(xù)升高，并在一定時間內(nèi)保持相對平穩(wěn)〔10〕。本實驗中，主要借助了UA前體物質(zhì)，UA排泄抑制劑及UA活性抑制劑進(jìn)行造模，不間斷進(jìn)行12 w，血UA持續(xù)升高并保持相對穩(wěn)定，但繼續(xù)造模至16 w時血UA繼續(xù)升高不明顯。另外腎損害是建立高UA ED模型過程中需考慮的重要問題〔11〕，本實驗在造模16 w時血Cr明顯升高，出現(xiàn)動物死亡，推測其死亡原因可能與腎功能損傷有關(guān)，但這也是本實驗的缺陷，沒有進(jìn)一步解剖大鼠探究其死亡原因。當(dāng)造模8 w時，APO(-) 高尿酸血癥大鼠的勃起功能呈顯著減弱趨勢，當(dāng)進(jìn)行12 w時，APO(+) 高尿酸血癥大鼠的勃起功能呈顯著減弱趨勢。因此，可以根據(jù)實驗?zāi)康牡囊蠛侠磉x擇造模時間，依據(jù)APO實驗篩選模型大鼠，而不必為獲取ED而做更長時間的造模，以減少動物的死亡率，降低實驗成本。

當(dāng)前部分學(xué)者采用APO實驗進(jìn)行糖尿病ED篩選，APO主要通過作用于中樞系統(tǒng)多巴胺受體，促進(jìn)勃起，研究表明皮下注射阿撲嗎啡，在無性刺激的情況下，可誘發(fā)大鼠的自發(fā)勃起〔12,13〕。除此之外，本試驗發(fā)現(xiàn)可以將APO實驗應(yīng)用至高UA ED的篩選。但此法的判定標(biāo)準(zhǔn)具有相對主觀性，對于動物同樣的表現(xiàn)，不同的研究者可能會產(chǎn)生不同的判斷。

借助電刺激動物陰莖海綿體神經(jīng)，以此來刺激勃起，測量海綿體內(nèi)壓，能夠準(zhǔn)確直觀地反映陰莖勃起功能，且為消除血壓對ICP的影響，采用ICP/MAP做比較，使觀察標(biāo)準(zhǔn)更客觀、更準(zhǔn)確〔14〕。對比空白對照組，造模8 w時，APO(-) 高尿酸血癥大鼠ICP/MAP明顯下降，且APO(-)高尿酸血癥大鼠ICP/MAP下降較APO(+)大鼠更為明顯，這樣的結(jié)論彌補(bǔ)了APO實驗判定標(biāo)準(zhǔn)主觀性的缺陷。通常情況下，ICP是評判其勃起功能的標(biāo)準(zhǔn)之一，準(zhǔn)確且便于重復(fù)，故應(yīng)用較為廣泛〔15〕。但實際操作中存在操作方法復(fù)雜，可能因術(shù)中損傷陰莖海綿體神經(jīng)導(dǎo)致電刺激無效等情況，對實驗者及實驗條件要求較高?？梢愿鶕?jù)實驗?zāi)康募皩嶒灄l件的不同，結(jié)合考慮使用APO實驗及ICP測定進(jìn)行篩選、評價。

綜上所述，由于直接在人體進(jìn)行性功能的相關(guān)研究受到倫理等多方因素的制約，所以非常有必要構(gòu)建高UA ED動物模型，以此來深入探究高UA ED的發(fā)病機(jī)制、藥理作用及解決措施等內(nèi)容。本實驗?zāi)M人體UA產(chǎn)生、代謝過程，成功建立了相對穩(wěn)定的高UA大鼠模型，采用APO實驗篩選高UA ED大鼠，ICP/MAP客觀評價高尿酸血癥大鼠勃起功能。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模12 w內(nèi)高尿酸血癥大鼠勃起功能下降與造模時間呈正相關(guān)，且APO(-)高尿酸血癥大鼠勃起功能更差。