地鱉蟲醇提物對腫瘤細胞侵襲與凋亡的作用機制

張慧明 富堯 白淑菊 劉爽 呂冬云

(佳木斯大學 1基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154002;2生命科學學院)

前列腺癌在世界范圍內發(fā)病率與死亡率呈逐年上升的趨勢，早期診斷可以通過手術治療提高前列腺癌患者的治愈率〔1〕。然而，晚期前列腺癌患者的死亡率較高，同時患者存在癌細胞多器官轉移的現(xiàn)象〔2〕?；瘜W療法在前列腺癌患者晚期治療階段起重要的作用，但是化學療法比較敏感，治療過程中機體會對化學藥物產生抗性，一旦復發(fā)化學療法由于抗化學性而變得無效〔3〕，需要尋找安全并且長久的靶向藥物來治療并減緩癌癥的轉移現(xiàn)象。

實驗證明，中藥對于惡性腫瘤有著很好療效〔4〕。地鱉蟲(ESW)是眾多常用作食物的昆蟲之一，是我國傳統(tǒng)的中藥，從古至今被用于治療許多不同的疾病，如瘀斑、創(chuàng)傷后傷口、肝纖維化和腫瘤。ESW有效成分中纖維蛋白物質抗腫瘤作用有報道〔5〕，但其醇提物對前列腺癌的作用方式尚未明確，本實驗研究ESW無水乙醇提取物(ESWE)抗腫瘤作用和潛在的信號傳導機制。

1 材料與方法

1.1材料 ESW粉末(國家標準物質網：編號121533)，PC3細胞，DMEM高糖培養(yǎng)液，F(xiàn)-12培養(yǎng)液，胎牛血清(FBS)Gibco進口分裝，青霉素，鏈霉素，吖啶橙溴乙錠(AO/EB)試劑盒(品牌solarbio)，實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒(生工生物公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，無水乙醇，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿等。細胞購于博士德公司。

1.2儀器 激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯FV1000)，倒置顯微鏡(萊卡)，酶標儀(BioTek)，超聲機(KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲機)，豎式電泳儀(北京六一)。

1.3細胞培養(yǎng) 細胞購自中國博士德生物科技有限公司，PC3細胞培養(yǎng)在含有10%FBS的F-12培養(yǎng)液中，均在37℃，5%的CO2條件下培養(yǎng)。

1.4醇提物的制備 將ESW粉末在無水乙醇中浸泡6 h，超聲溫度50℃，超聲時間40 min，旋轉蒸發(fā)儀提純，醇提物溶于二甲基亞砜(DMSO)4℃儲存，對照組加入相同劑量DMSO作為對照。

1.5ESWE對腫瘤細胞的抑制作用 將PC3細胞(1×104個)在96孔板中培養(yǎng)，醇提物濃度梯度為2、4、6、8、10、12 mg/ml。種板后24 h加藥同時設置對照組，每組3個復孔。藥物作用48 h。加入CCK8液100 μl/孔(CCK8∶培養(yǎng)液=1∶9)，1 h后酶標儀波長450 nm下檢測吸光度值A。實驗重復3次。用公式計算細胞增殖抑制率。Graphpad軟件分析IC50值。

1.6劃痕實驗 取對數(shù)生長期細胞PC3(1×105個)接種于6孔板，3個復孔。細胞生長完全融合后，用黃色的槍頭在孔板底部輕輕劃直線，PBS清洗2次繼續(xù)培養(yǎng)。取藥物濃度低劑量(2.0 mg/ml)、高劑量(4.0 mg/ml)為實驗組，正常培養(yǎng)為對照組。藥物作用48 h，倒置顯微鏡觀察細胞融合度并拍照。PC3細胞的運動能力用劃痕愈合百分率來表示。

1.7遷移侵襲實驗 transwell小室做細胞遷移侵襲能力測定，將PC3細胞血清饑餓24 h，然后在含有醇提物的無血清培養(yǎng)基中鋪板(1×104細胞/孔)在24孔板的上室中濃度為2.0 mg/ml，4.0 mg/ml。下室填充1.5 ml含有10%FBS的培養(yǎng)基。作用48 h后，用棉簽刮下保留在膜上表面的細胞，甲醇∶冰乙酸(3∶1)固定30 min，吉姆薩染色15 min，清洗，晾干，倒置顯微鏡下拍照并計數(shù)。每組3個小室，每個小室選10個視野計數(shù)。

1.8AO/EB凋亡實驗 取對數(shù)生長期細胞(PC3)1×105個/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，爬片處理，分別取2.0 mg/ml，4.0 mg/ml為實驗組，正常培養(yǎng)為對照組，每組分別鋪3個復孔，37℃培養(yǎng)，細胞密度達到70%時，應用AO/EB試劑盒觀察細胞凋亡現(xiàn)象，激光共聚焦顯微鏡觀察。AO/EB 測細胞凋亡，AO與核內DNA結合呈現(xiàn)綠色熒光，可以透過完整的膜。EB與核內DNA結合呈現(xiàn)橘紅色熒光，不能透過完整核膜。凋亡的細胞核呈現(xiàn)熒光加強，形態(tài)皺縮成塊狀或圓珠狀。

1.9檢測細胞中Integrin(ITG)β1、ITG連接激酶(ILK)、纖維型肌動蛋白(F-actin)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3 mRNA相對表達量 PC3細胞常規(guī)培養(yǎng)，90%融合度時加入不同劑量組藥物作用。48 h后加入TRIzol裂解細胞收集裂解液，提取總RNA，PCR反轉錄，qPCR均使用生工試劑盒構建，按說明書完成，所用引物為GAPDH正義鏈：5′AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反義鏈：5′AGGGG CCATCCACAGTCTTC-3′。ITGβ1正義鏈：5′-ACCTG CCTTGGTGTCTGTG-3′，反義鏈：5′-CAACTTCTCCC TGCTTTCCA-3′。ILK正義鏈：5′-GACGAAGCTCA ACGAGAA-3′，反義鏈：5′-AGTCCCTGCTCTTCCTTGT-3′。F-actin正義鏈：5′-CTCCATCCTGGCCTC GCTGT-3′，反義鏈：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。Caspase3正義鏈：5′-ACTGGAAAGCCGAAACTC TTCATCA-3′，反義鏈：5′-GGAAGTCGGCCTCCACTGGTATC-3′。

1.10免疫印跡(WB)實驗 蛋白制備：取對數(shù)生長期細胞(PC3)1×105個/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，細胞密度接近90%時，加藥。分別取2.0、4.0 mg/ml為實驗組，正常培養(yǎng)為對照組，每組分別鋪3個復孔，37℃培養(yǎng)，48 h后提蛋白。沸水使其變性，-80℃保存。WB：蛋白樣品上樣-電泳-轉膜-5%的血清白蛋白(BSA)封閉-封一抗(ITGβ1、ILK、F-actin、Caspase3)分別1∶1 000配比，4℃搖動過夜。次日，洗膜-封入抗兔、抗鼠二抗，1∶4 000配比，洗膜。條帶顯色3 min，曝光時間根據蛋白的不同而有差異(5 s至5 min)。

1.11數(shù)據分析 采用Graphpad8.0軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1ESWE對腫瘤細胞的抑制作用 不同濃度的ESWE對PC3細胞具有比較明顯的抑制作用，2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/ml的抑制率分別為(7.58±2.60)%、(20.92±5.40)%、(42.55±12.60)%、(68.47±4.80)%、(86.47±1.79)%、(90.15±1.11)%。其中對PC3的IC50值為6.265 mg/ml。

2.2ESWE對PC3細胞遷移能力的影響 與0 h對比，作用48 h后對照組遷移率為93.6%±2.3%，2.0、4.0 mg/ml組遷移率分別為70.2%±2.0%、60.6%±1.8%，見圖1，隨著藥物濃度的增加遷移率逐漸降低。

圖1 劃痕實驗檢測作用不同時間PC3細胞遷移能力(×50)

2.3ESWE對PC3細胞侵襲能力的影響 用生長48 h的PC3細胞通過transwell小室的數(shù)目來計算細胞的侵襲能力，對照組侵襲數(shù)為(107.6±2.0)個，2.0、4.0 mg/ml組分別為(70.8±1.6)個、(42.8±1.5)個，隨藥物濃度的升高侵襲能力逐漸減弱(P<0.01)。見圖2。

圖2 transwell實驗檢測PC3細胞株侵襲能力(吉姆薩染色，×100)

2.4ESWE對PC3細胞凋亡的影響 對照組細胞核呈規(guī)則形態(tài)，未見凋亡現(xiàn)象。2.0 mg/ml組細胞核出現(xiàn)明顯的皺縮現(xiàn)象，呈早期凋亡的現(xiàn)象。4.0 mg/ml組多個細胞核呈現(xiàn)皺縮、塊狀，呈晚期凋亡現(xiàn)象，見圖3。藥物可促進PC3細胞凋亡，并呈劑量依賴。

2.5ESWE對PC3細胞 ITGβ1、ILK、F-actin、Caspase3 mRNA表達的影響 隨著ESWE濃度的增加ITGβ1 mRNA表達量4.0mg/ml組顯著低于2.0 mg/ml組，2.0、4.0 mg/ml組顯著低于對照組(P<0.05)；ILK mRNA表達量2.0、4.0 mg/ml組低于對照組且具有顯著性差異(P<0.05)，4.0 mg/ml組與2.0 mg/ml組無顯著差異性(P>0.05)；F-actin mRNA表達量沒有明顯變化；而Caspase3 mRNA表達量2.0、4.0 mg/ml組與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，4.0 mg/ml組與2.0 mg/ml組不具有顯著差異性(P>0.05)。見表1。

箭頭所示為細胞凋亡圖3 PC3細胞凋亡(AO/EB染色，×600)

表1 ITGβ1、ILK、F-actin、Caspase3mRNA相對表達量比較

2.6ESWE對PC3細胞ITGβ1、ILK、F-actin、Capase3蛋白表達的影響 隨ESWE濃度升高ITGβ1、ILK、F-actin表達量均下降，ITGβ1 2.0 mg/ml組與對照組差異不顯著(P>0.05)，4.0 mg/ml組與2.0 mg/ml組、對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；ILK 2.0 mg/ml組與對照組、4.0 mg/ml組比較具有顯著性差異(P<0.05)，F(xiàn)-actin 2.0 mg/ml組與對照組比較差異不顯著(P>0.05)，2.0 mg/ml組與4.0 mg/ml組比較有顯著性差異(P<0.05)；Caspase3表達量隨ESWE濃度升高逐漸上升，2.0 mg/ml組與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，4.0 mg/ml組與2.0 mg/ml組比較有顯著性差異(P<0.05)。見圖4，表2。

圖4 WB檢測各組ITGβ1/ILK/F-actin及Caspase3蛋白水平

表2 各組ITGβ1/ILK/F-actin及Caspase3灰度值

3 討 論

ESW為中國著名的食用和藥用昆蟲，用作傳統(tǒng)醫(yī)學骨損傷、血瘀和免疫相關疾病的治療?，F(xiàn)代藥理研究表明ESWE可以抑制各種腫瘤的生長〔6〕。本實驗從ESW粉末中通過化學提純的方法提取醇提物〔7〕體外作用前列腺癌細胞PC3。本實驗得出ESWE可以降低ITGβ1、ILK并上調Caspase3蛋白質表達，ESWE的抗侵襲作用是前列腺癌細胞通過ITGβ1降解細胞外基質(ECM)成分調節(jié)ILK與F-actin表達，上調Caspase3表達促進細胞凋亡。

腫瘤細胞侵襲與轉移是腫瘤細胞的特點，這與ECM層黏連蛋白與腫瘤表面受體相互結合從而降解ECM，構成局部溶解通道，從而降低細胞黏附性有直接聯(lián)系〔8〕。 ITGβ1介導細胞與ECM層黏連蛋白的黏附能力〔9〕，ITGβ1表達量高則細胞黏附性弱，反之則強。ITG家族本身不具有激酶的活性，與ECM結合后激活ILK招募Paxillin、Parvin、Plectin等與actin相結合從而啟動ITG信號通路，調節(jié)骨架蛋白F-actin的組裝〔10〕。ILK靶向催化絲/蘇氨酸蛋白激酶(PKB/Akt)，PKB磷酸化下游蛋白底物糖原合成酶激酶(GSK)-3β調節(jié)細胞凋亡〔11〕。PKB/GSK3β活化后可以減少因線粒體膜通透性改變所引起的細胞凋亡,并顯著降低Caspase3的表達及活性〔12〕。

在一些研究中已經報道了ESW可溶性蛋白的抗腫瘤活性〔5〕，醇提物與腫瘤的抑制作用相關研究很少，其抗腫瘤機制尚不清楚。本研究證明ESWE通過 ITGβ1/ILK/F-actin信號途徑參與前列腺癌細胞的遷移與侵襲過程，在此過程中影響了微絲骨架蛋白F-actin重構，但并不影響其總量的表達。同時ILK可調節(jié)下游蛋白Caspase3促進PC3細胞凋亡。本研究結果可為新的腫瘤治療藥物的研究提供理論實驗依據。

致謝:黑龍江省北藥與功能食品優(yōu)勢特色學科建設項目提供資助！