竹葉石膏湯改善2型糖尿病大鼠記憶功能衰退癥狀的作用機(jī)制

李玉潔 李雪瑩 陳瑩瑩 李藝璇 安敬文 王聰慧 張肖雅 楊麗萍

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2第一臨床醫(yī)學(xué)院)

2017年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)發(fā)布的《糖尿病地圖》中顯示，全球約有4.25億糖尿病患者，推測(cè)到2045年，全球糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到6.29億，中國(guó)患病人數(shù)將達(dá)1.343億〔1〕。糖尿病屬于慢性疾病，是由于胰島素分泌或作用缺陷所引起的代謝性疾病〔2〕，而絕大多數(shù)糖尿病患者罹患的是2型糖尿病(T2DM)〔3〕。流行病學(xué)研究報(bào)告指出，T2DM是發(fā)生認(rèn)知功能障礙和癡呆的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且該病導(dǎo)致患者日后發(fā)生癡呆的概率約為正常人的1.6倍〔4〕。研究指出，糖尿病患者并發(fā)認(rèn)知功能減退(CI)的發(fā)生率為10.8%～17.5%，輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)是阿爾茨海默病(AD)的早期階段，每年有10%～15% 會(huì)演變?yōu)锳D〔5〕。藥物干預(yù)是治療糖尿病及其并發(fā)癥的有效途徑，但目前已有的降糖藥對(duì)于T2DM引起的記憶力下降尚沒(méi)有較好的治療作用，因此探索T2DM發(fā)生認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制，尋找有效的治療藥物，對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的預(yù)防和治療有重大意義。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)消渴范疇，基本病機(jī)為陰津虧耗，燥熱偏盛〔6〕。本證治法若只取清熱而不益氣生津，則氣液難復(fù)；若只益氣生津而不清熱，又慮邪熱復(fù)熾，余熱復(fù)燃。正如葉天士所說(shuō)“爐煙已息，灰中有火”。竹葉石膏湯首見(jiàn)于《傷寒論》，由竹葉、石膏、麥冬、人參、半夏、粳米、炙甘草組成，此湯清熱養(yǎng)陰，益氣生津，為療效優(yōu)越的清補(bǔ)之劑，既在于清，又在于補(bǔ)，扶正祛邪，重在調(diào)和，被稱為“以大寒之劑，易為清補(bǔ)之方”，主要用于治療消渴癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，方中人參的主成分人參皂苷Rg1具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用〔7〕；竹葉中竹葉黃酮可以提高大鼠海馬神經(jīng)元的存活率〔8〕；半夏中的鳥(niǎo)苷依賴G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔9〕等。但目前，關(guān)于竹葉石膏湯改善T2DM記憶力下降的相關(guān)研究幾乎沒(méi)有，因此本實(shí)驗(yàn)觀察竹葉石膏湯對(duì)T2DM大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 鏈脲佐菌素(STZ)北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：18883-66-4；安穩(wěn)型血糖試條，三諾生物傳感股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)2804NR；豬油，浙江金恩食品有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20180809；蛋黃粉，河南宏益生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20180628；豬膽鹽，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號(hào)20180605；膽固醇，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)108D113，50%葡萄糖溶液，開(kāi)封制藥集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：H41022336；大鼠β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒，東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品貨號(hào)：DRE20040；大鼠胰島素ELISA試劑盒，東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)：DRE20732；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒，東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品貨號(hào)：DRE20040，蛋白定量測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，貨號(hào)：A045-2。

1.2中藥制備 竹葉石膏湯中藥免煎劑均購(gòu)自廣東一方制藥有限公司，用藥量按千克體重折算系數(shù)法計(jì)算大鼠等效劑量，使用時(shí)將粳米熬湯，過(guò)濾，用米湯溶解藥物。

1.3儀器 MultisKanFc酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))；KDC-160HR低溫高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；AB204-N萬(wàn)分之一精密分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。Morris水迷宮(成都太盟軟件有限公司)

1.4動(dòng)物 8周齡，SPF級(jí)雄性SD大鼠10只，體重(320±20)g，72周齡，SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，體重(530±30)g，均購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(晉)20150001，實(shí)驗(yàn)室保持12 h光照，12 h避光循環(huán)飼養(yǎng)，按照組別分別給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和高糖高脂飼料，自由飲水。實(shí)驗(yàn)室溫度20～25℃，濕度50%～60%。

1.5分組及建模

1.5.1T2DM大鼠模型的誘導(dǎo) 取8周齡青年雄性大鼠10只，設(shè)為正常組，給予正常飼料喂養(yǎng)，另取72周齡老年雄性大鼠50只采用高糖高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ，45 mg/kg)誘導(dǎo)T2DM大鼠模型〔6〕，具體方法為，所有造模大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)1 w后，禁食不禁水24 h，之后大鼠腹腔注射STZ 45 mg/kg，3 d后檢測(cè)空腹血糖，空腹血糖值≥16.7 mmol/L，視為建模成功〔10〕。高脂飼料配方，參照AIN-93G嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合成飼料配方〔11〕配制方法如下：豬油40 g，膽固醇40 g，膽鹽20 g，蛋黃粉40 g，普通飼料600 g，蒸餾水適量。充分?jǐn)嚢韬罅栏?，制成長(zhǎng)為0.8 cm的條狀飼料。

1.5.2動(dòng)物的分組給藥 將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組,竹葉石膏湯低劑量(低劑量)組、竹葉石膏湯高劑量(高劑量)組，每組10只，低劑量及高劑量組每天灌胃竹葉石膏湯水煎液，模型組與正常組每天灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)給藥14 d。

低劑量組用藥量為臨床人用藥量的6.25倍；高劑量組用藥量為臨床人用藥量的20倍；正常組及模型組每日灌胃生理鹽水，給藥體積均為4 ml。

1.6指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力〔12〕，①定位巡航實(shí)驗(yàn)：給藥后10 d開(kāi)始進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，連續(xù)訓(xùn)練3 d，每天從4個(gè)不同象限中點(diǎn)將大鼠放入水池(頭朝池壁)，任其在水中游泳，讓其自行尋找平臺(tái)，爬上平臺(tái)后讓其在平臺(tái)上停留10 s，以使其強(qiáng)化記憶效果，若在60 s內(nèi)未能爬上平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)人員將大鼠引導(dǎo)至目標(biāo)平臺(tái)，同樣讓其在平臺(tái)停留10 s(平臺(tái)放置于第1象限，距圓點(diǎn)1/3處)。②空間探索實(shí)驗(yàn)：定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h，撤除平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將大鼠從原平臺(tái)對(duì)側(cè)象限中點(diǎn)放入，任其自由游泳90 s，用影像記錄系統(tǒng)記錄大鼠穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間及中心活動(dòng)時(shí)間。

1.6.2生化指標(biāo)檢測(cè) 于給藥后第9天進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)，大鼠禁食12 h后，灌胃2 g/kg葡萄糖溶液，分別于灌胃前(0 min)、灌胃葡萄糖溶液后30 min、60 min及120 min檢測(cè)大鼠血糖水平〔13〕。

于給藥后第14天行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠摘眼球取血，分離血清，之后處死大鼠，迅速于冰面上分離海馬體，并用冷的生理鹽水制作1%海馬體組織勻漿，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩０丛噭┖兄甘緳z測(cè)大鼠血糖、空腹胰島素水平，并檢測(cè)大鼠海馬組織TNF-α及Aβ1～42含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況觀察 與正常組相比，模型組大鼠的進(jìn)食量、飲水量及尿量有升高趨勢(shì)且飲水量、尿量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，低、高劑量組進(jìn)食量、飲水量及尿量呈下降趨勢(shì)，且除低劑量組攝食量外差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 竹葉石膏湯對(duì)T2DM大鼠模型攝食量、飲水量及尿量的影響

2.2竹葉石膏湯對(duì)T2DM大鼠體重的影響 與造模前比較，造模后模型組及低、高劑量組大鼠體重均顯著下降(P<0.01)。給藥后，模型組體重持續(xù)下降，與造模后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低、高劑量組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但各組(除正常組)與自身造模后(即給藥前)體重相比明顯降低，但低劑量組大鼠體重降低比例最小。正常組各時(shí)間點(diǎn)體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見(jiàn)表2。

表2 竹葉石膏湯對(duì)T2DM模型大鼠體重的影響

2.3竹葉石膏湯對(duì)T2DM大鼠模型OGTT的影響 給藥3 d后，正常組大鼠空腹血糖在正常范圍，口服定量葡萄糖后15 min升到峰值，30 min時(shí)恢復(fù)至正常水平；與正常組相比，模型組大鼠空腹血糖顯著升高(P<0.01)，口服定量葡萄糖后30 min血糖升至峰值，60 min時(shí)仍未恢復(fù)至空腹血糖水平，120 min時(shí)血糖濃度恢復(fù)至空腹血糖水平，各時(shí)間點(diǎn)血糖均顯著升高，與正常組比較均有顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，低劑量組大鼠空腹血糖顯著性降低(P<0.05)，但仍顯著高于正常組(P<0.01)，口服定量葡萄糖后15 min血糖水平達(dá)到峰值，30～120 min呈下降趨勢(shì)，但120 min時(shí)，血糖仍未恢復(fù)至空腹血糖水平，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；高劑量組大鼠空腹血糖基本恢復(fù)正常水平，與正常組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，與模型組比較有顯著差異(P<0.01)，口服定量葡萄糖后15 min血糖水平達(dá)到峰值，30～120 min呈下降趨勢(shì)，120 min時(shí)血糖濃度基本恢復(fù)至空腹血糖水平，與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)，與正常組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 竹葉石膏湯對(duì)T2DM大鼠模型口服葡萄糖不同時(shí)間糖耐量的影響

2.4竹葉石膏湯對(duì)T2DM大鼠空腹血糖及胰島素水平的影響 與正常組比較，模型組空腹血糖水平顯著升高(P<0.01)，空腹胰島素水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，末次給藥后，低、高劑量組大鼠空腹血糖水平均顯著降低(P<0.01)，血清胰島素水平有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 竹葉石膏湯對(duì)T2DM大鼠空腹血糖及血清胰島素水平的影響

2.5竹葉石膏湯對(duì)T2DM大鼠海馬TNF-α及Aβ1～42水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠海馬TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量組大鼠海馬組織TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。海馬Aβ1～42水平檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組及各用藥組海馬Aβ1～42水平變化均不明顯，各組間比較均無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 竹葉石膏湯對(duì)T2DM大鼠海馬TNF-α及Aβ1～42水平的影響

2.6竹葉石膏湯對(duì)T2DM大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，給藥14 d后，目標(biāo)象限停留時(shí)間檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組及各用藥組，在原站臺(tái)所在象限(即目標(biāo)象限)停留時(shí)間變化均不明顯，各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組比較，模型組中心活動(dòng)時(shí)間顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組大鼠中心活動(dòng)時(shí)間顯著升高(P<0.01)，但高劑量組大鼠中心活動(dòng)時(shí)間變化不明顯，與模型組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。與正常組比較，模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，低劑量組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著升高(P<0.01)，同樣，高劑量組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)變化也不明顯，與模型組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表6。

表6 竹葉石膏湯對(duì)T2DM大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

3 討 論

建立理想的糖尿病模型是糖尿病發(fā)病機(jī)制和臨床新藥研發(fā)的基礎(chǔ)，目前T2DM模型主要分為：自發(fā)型糖尿病模型動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物和誘發(fā)性糖尿病模型動(dòng)物。其中自發(fā)型糖尿病模型與轉(zhuǎn)基因糖尿病模型動(dòng)物因價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)要求高，在國(guó)內(nèi)較少應(yīng)用〔14〕。誘發(fā)性糖尿病模型動(dòng)物在國(guó)內(nèi)應(yīng)用較為廣泛，通常采用各種物理或化學(xué)的方法損傷部分胰臟或胰島 β 細(xì)胞導(dǎo)致胰島素分泌不足，同時(shí)結(jié)合高糖高脂飼料喂養(yǎng)，造成外周組織對(duì)胰島素不敏感，引起高血糖癥狀，病理生理改變符合人類(lèi)T2DM〔15〕。 藥物誘導(dǎo)的糖尿病模型具有發(fā)病率高、造模時(shí)間較短，且價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用72周齡，雄性老年大鼠，高糖高脂飼料喂養(yǎng)1 w后，腹腔注射小劑量STZ，成功建立了T2DM大鼠模型，造模時(shí)間較短，價(jià)格低廉，病理生理改變符合人類(lèi)T2DM發(fā)病過(guò)程，為T(mén)2DM動(dòng)物模型的建立提供了新思路。

T2DM認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制至今仍未能被完全闡明?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病原因可能與腦內(nèi)代謝異常、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、炎癥因子、胰島素抵抗(IR)、Aβ1～42的過(guò)度表達(dá)、tau蛋白磷酸化、腦血管損傷、微血管、大血管病變及氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)〔16〕。上述因素間的因果關(guān)系也是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，Winocur等〔17〕與Kamal等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)IR在T2DM大鼠記憶力下降的過(guò)程中起著十分重要的作用〔17,18〕。糖代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致TNF-α水平升高，Aβ1～42發(fā)生非酶糖基化，形成糖基化終末產(chǎn)物，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，甚至影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，從而引起認(rèn)知功能損傷〔19〕。周莉等〔20〕研究也發(fā)現(xiàn)存在認(rèn)知功能障礙的糖尿病患者較非認(rèn)知功能障礙糖尿病患者血清Aβ1～42水平顯著升高，說(shuō)明Aβ1～42在T2DM患者體內(nèi)的過(guò)度表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致T2DM認(rèn)知功能障礙發(fā)病。

另一方面，炎癥反應(yīng)也是糖尿病患者認(rèn)知功能減退的重要原因之一〔21〕，臨床研究顯示：血清IL-6和TNF-α水平升高是T2DM患者認(rèn)知功能下降的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素〔22〕。TNF-α是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，當(dāng)患者長(zhǎng)期處于高血糖水平時(shí)，體內(nèi)分泌的某些糖基化產(chǎn)物會(huì)激活巨噬細(xì)胞，使其分泌TNF-α，而過(guò)度表達(dá)的TNF-α?xí)蓴_胰島功能及糖代謝，進(jìn)而造成神經(jīng)的損傷，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙〔22〕；另一方面，TNF-α還可以透過(guò)血腦屏障，通過(guò)促進(jìn)海馬組織胰島素受體絲氨酸磷酸化，促進(jìn)認(rèn)知功能障礙〔23〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明竹葉石膏湯對(duì)T2DM有較好的改善作用，這一結(jié)果與裴晶等〔24〕的報(bào)道一致，竹葉石膏湯可能通過(guò)抑制炎癥因子的生成，改善糖尿病大鼠記憶力減退癥狀。意外的是，我們發(fā)現(xiàn)該方法誘導(dǎo)的T2DM大鼠海馬Aβ1～42水平變化并不明顯，竹葉石膏湯對(duì)海馬Aβ1～42水平的變化也沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抑制作用，這可能與糖尿病發(fā)病時(shí)間較短的原因有關(guān)，同時(shí)也說(shuō)明T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙發(fā)生初期主要與炎癥反應(yīng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，竹葉石膏湯高劑量組空腹血糖及海馬TNF-α水平均顯著降低，但學(xué)習(xí)記憶能力卻沒(méi)有顯著升高，推測(cè)可能是由于竹葉石膏湯中半夏的中樞神經(jīng)麻醉作用所至〔25〕，有待進(jìn)一步研究。