上海地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及耐藥性分析

朱寧，趙艷坤，陳賀，王富蘭，王帥，李應彪

（1.石河子大學食品學院，石河子 832003；2.新疆農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，農業(yè)農村部農產品質量安全風險評估實驗室（烏魯木齊），新疆農產品質量安全實驗室，烏魯木齊 830091）

乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，該病成因復雜、發(fā)病率高[1]且較難治愈，造成經濟損失嚴重，給奶業(yè)健康發(fā)展帶來巨大挑戰(zhàn)[2～4]。目前，對奶牛乳房炎的防制仍以抗生素治療為主，從而造成了藥物殘留等問題。此外，在臨床治療過程中由于盲目使用或濫用抗生素，致使耐藥菌株不斷產生，給臨床防治帶來巨大的困難，嚴重威脅著我國的動物性食品安全[5～7]。奶牛乳腺發(fā)炎的成因復雜，病原微生物感染、物理性損傷和化學物質刺激等都會引起其發(fā)生，其中病原微生物尤其是細菌病原體的入侵感染是引發(fā)奶牛乳房炎的主要病因。馮小慧等對2017年上海、河北地區(qū)奶牛乳房炎進行細菌分離鑒定及耐藥性分析，得出該地區(qū)乳房炎與克雷伯氏菌感染密切相關，且存在不同程度耐藥性[8]。易明梅等對上海地區(qū)奶牛乳房炎主要病原菌進行分離鑒定及耐藥性分析，得出該地區(qū)奶牛乳房炎以金黃色葡萄球菌的單獨感染以及金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌混合感染為主[9]。趙高乾等指出金黃色葡萄球菌是公認的奶牛乳房炎的主要傳染性病原菌，無乳鏈球菌在中國感染率較高，大腸埃希氏菌作為主要環(huán)境性病原體，均普遍存在耐藥性，其中，無乳鏈球菌對大部分抗生素仍舊敏感，治愈率較高[10]。由于地域、氣候、奶牛生產管理手段的差異性，致使各地奶牛乳房炎病原菌感染情況也有所不同，目前奶牛乳房炎致病菌以大腸埃希氏菌、克雷伯氏菌屬、鏈球菌以及金黃色葡萄球菌為主，且均存在不同程度的耐藥性[11]。本研究以上海地區(qū)乳房炎患牛為研究對象，從牧場采集患病牛乳樣，同時進行細菌分離鑒定，并對主要病原菌進行藥敏試驗及耐藥性分析。通過對上海地區(qū)56個牧場臨床型乳房炎奶樣中的致病菌進行分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢、生化鑒定，并對主要病原菌分離株進行體外藥物敏感性試驗和耐藥性分析，以減少抗生素的誤用、濫用、過用和殘留，以期為疫苗研制、敏感藥物篩選以及奶牛乳房炎的預防和臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

培養(yǎng)基與試劑：鮮血瓊脂、麥康凱瓊脂、甘露醇高鹽瓊脂，購自北京陸橋技術股份有限公司；哥倫比亞血瓊脂，購自上?？片敿挝⑸锛夹g有限公司；細菌微量生化鑒定管（兔血漿）、葡萄糖、3%過氧化氫、甘露醇、山梨醇、七葉苷、尿素酶、靛基質、西蒙氏枸櫞酸鹽、三糖鐵，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；40%膽汁培養(yǎng)基、蕈糖、馬尿酸鹽，購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；革蘭氏染液，購自新疆寶信源柏生物技術有限公司。

藥敏板：革蘭氏陰性定制藥敏板、革蘭氏陽性定制藥敏板，購自天津市金章科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集

71份樣品采自上海市崇明區(qū)、奉賢區(qū)、浦東新區(qū)、金山區(qū)、嘉定區(qū)和江蘇省蘇州市、泰州市56個不同規(guī)模牧場乳房炎患牛的混合奶樣。各取50mL于無菌采樣瓶中，標記，冷藏，24h之內送回實驗室進行細菌分離。

1.2.2 細菌分離與純化

將乳樣搖勻，無菌操作，用接種環(huán)取2～3環(huán)待檢乳樣，間斷劃線接種于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、甘露醇高鹽瓊脂平板上，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～48h，肉眼觀察菌落的生長狀態(tài)和菌落形態(tài)，挑取典型菌落，劃線純化，對其進行唯一性編號。

接著對典型單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，根據菌落形態(tài)及染色特征初步判定細菌類屬，并將其進一步純化培養(yǎng)。

1.2.3 細菌的生化鑒定

將分離純化的細菌分類增菌后，分別進行生化鑒定。包括凝固酶試驗，甘露醇、山梨醇和七葉苷發(fā)酵試驗，枸櫞酸鹽利用試驗、糖類試驗、靛基質試驗、H2S試驗等。

1.2.4 藥敏試驗

對分離的金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌和克雷伯氏菌4種目標菌株進行藥物敏感性試驗，并按照美國臨床實驗室標準委員會（CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法進行細菌最小抑菌濃度（MIC）值測定。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離結果

經對71份臨床型乳房炎奶樣進行生化鑒定，鑒定出目標菌：金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌和克雷伯氏菌。糞腸球菌的分離率是7.0%（5/71），克雷伯氏菌的分離率是11.3%（8/71），大腸桿菌的分離率是15.5%（11/71），金黃色葡萄球菌的分離率是16.9%（12/71），其中金黃色葡萄球菌是公認的奶牛乳房炎的主要傳染性病原菌，分離率最高（表1）。由此可見，金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌和克雷伯氏菌為該地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病菌，主要患病途徑是細菌傳染。

表1 細菌的分離結果 單位：份，%

2.2 各菌藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示，上海地區(qū)分離的12株金黃色葡萄球菌對15種抗菌藥物均表現(xiàn)高度敏感，敏感率達91.7%～100.0%，對15種臨床常用抗菌藥物的耐藥性較低甚至無耐藥產生（表2）。

表2 分離的12株金黃色葡萄球菌對常見的15種藥物藥敏試驗結果

上海地區(qū)分離的5株糞腸球菌對氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻呋、多西環(huán)素、利福平、萬古霉素、環(huán)丙沙星、磺胺異唑和復方新諾明的敏感率較高，達60%～100%，對頭孢噻吩完全耐藥，耐藥率100%，其次是青霉素、苯唑西林、紅霉素、克林霉素和慶大霉素，耐藥率均為60%（表3）。

表3 分離的5株糞腸球菌對常見的15種藥物藥敏試驗結果

上海地區(qū)分離的11株大腸桿菌對阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻呋、美羅培南、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、多黏菌素E、利福平、環(huán)丙沙星、磺胺異唑和復方新諾明表現(xiàn)高度敏感，敏感率達63.6%～100%，僅對頭孢噻吩表現(xiàn)出耐藥，耐藥率達72.7%（表4）。

表4 分離的11株大腸桿菌對常見的15種藥物藥敏試驗結果

上海地區(qū)分離的8株克雷伯氏菌對頭孢噻呋、美羅培南、鏈霉素、卡那霉素、氟苯尼考、多黏菌素E和環(huán)丙沙星的敏感性較高，敏感率達62.5%～100%，對氨芐西林、慶大霉素、四環(huán)素、磺胺異唑和復方新諾明表現(xiàn)耐藥，耐藥嚴重程度為氨芐西林=磺胺異唑=慶大霉素（75%）＞四環(huán)素（62.5%）＞復方新諾明（50%），見表5。

2.3 多重耐藥結果

由上海地區(qū)分離的金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌和克雷伯氏菌4種菌的多重耐藥結果顯示，金黃色葡萄球菌無多重耐藥情況，糞腸球菌對3種、4種、5種和6種藥物多重耐藥，大腸桿菌對3種、6種和9種藥物多重耐藥，克雷伯氏菌對5種、6種、8種和10種藥物多重耐藥；大腸桿菌和克雷伯氏菌多重耐藥的情況比較嚴重，對9種、10種抗菌藥物多重耐藥（圖1）。

圖1 多重耐藥結果

3 討論

乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)的常見病[12]，會造成產奶量下降、奶品質降低，進而影響人體健康，嚴重制約著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本試驗通過對采集的71份乳房炎患牛奶樣進行分離鑒定，顯示引起上海地區(qū)奶牛場奶牛乳房炎的主要病原菌為金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌和克雷伯氏菌，這與國內易明梅等對上海地區(qū)的分析結果存在一定的差異[9]，表明同一地區(qū)、不同奶牛場之間，引起奶牛乳房炎的主要病原菌的比率有所不同，這可能與各奶牛場的飼養(yǎng)管理習慣、抗生素的選用以及樣品采集季節(jié)的不同有一定關系。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，4種主要病原菌對頭孢噻吩、氨芐西林、磺胺異唑均表現(xiàn)不同程度的耐藥，耐藥率高達75.00%～100.00%，對頭孢噻呋、環(huán)丙沙星、阿莫西林-克拉維酸抗菌藥物敏感，敏感率在60.0%～100.0%，這與國內賈智麗等對包頭地區(qū)的分析結果[13]大致相同。薛梅等[14]對山東省濰坊市奶牛場病原微生物的分析結果顯示，主要病原菌對頭孢噻呋抗菌藥物較敏感，這與本試驗結果基本一致，推測可能與奶牛場管理不合理[15,16]，在臨床治療乳房炎時未能及時進行細菌分離鑒定，通過藥敏試驗選擇敏感藥物有關。因此，環(huán)丙沙星及頭孢噻呋抗生素可在一定時期內作為上海地區(qū)乳房炎治療的首選藥物。頭孢噻吩、氨芐西林、磺胺異唑可為淘汰用藥。

從多重耐藥性的結果分析，多重耐藥菌株共16株，占22.5，存在對9、10種抗菌藥物耐藥，這同高曉偉等對長春地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的耐藥性評估中存在多重耐藥，甚至存在對5～10種抗生素耐藥的情況[17]保持一致，這與不合理使用抗生素，經常使用一種或幾種抗生素、亂用、濫用等情況有關。因此，在防制乳房炎時應對癥合理用藥[18]，以達到早發(fā)現(xiàn)早治療的目的，減少多重耐藥性的產生。

目前治療奶牛乳房炎的主要方法還是應用抗生素，但即使科學、靶向用藥，長期的抗生素使用也會使得傳統(tǒng)藥物的作用效果下降，藥物殘留也致使乳制品質量下降，危及人類健康。因此，應積極研究奶牛乳房炎的其他有效治療方法，如中藥療法、中西醫(yī)結合療法、基因療法、生物療法、物理療法等，為奶牛乳房炎的治療提供新的思路[19,20]。

4 結論

通過對上海地區(qū)部分奶牛場71份臨床型乳房炎患牛奶樣進行細菌分離鑒定，并對主要病原菌進行藥敏試驗，顯示該地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞腸球菌、克雷伯氏菌，這些病原菌對氨芐西林、磺胺異唑、慶大霉素具有較強耐藥性；對頭孢噻呋、環(huán)丙沙星、阿莫西林-克拉維酸抗菌藥物敏感，上述研究結果可為上海地區(qū)奶牛乳房炎的防制提供可靠的理論依據。