恒河猴肺中陰溝腸桿菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

李艷艷,禹文海,楊鳳梅,劉 權(quán),陳麗雄,王俊斌,馬 進(jìn),徐鴻界,楊亞平,趙 遠(yuǎn),和占龍

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650118)

陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)在自然界中廣泛存在,在人和動(dòng)物的糞便、水、泥土、植物中都可檢出。 該菌為條件性致病菌,特定條件下能感染呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多個(gè)器官系統(tǒng),同時(shí)也可感染創(chuàng)口,嚴(yán)重時(shí)引發(fā)敗血癥等[1]。 老年人和抵抗力降低的病人是該菌的易感人群。 該菌也可導(dǎo)致兒童腦膜炎、腦梗塞、腦膿腫和腦囊腫等疾病, 甚至引起死亡。 因此,陰溝腸桿菌已成為引起醫(yī)院內(nèi)感染的一種重要的病原菌。 另外,陰溝腸桿菌B29 是國(guó)際上公認(rèn)的“肥胖細(xì)菌”,它是造成肥胖的直接元兇之一[2]。 大量研究報(bào)道,由于抗生素類(lèi)藥物的不合理使用,使陰溝腸桿菌對(duì)多種抗菌藥物具有較高的耐藥性[3-4],陰溝腸桿菌普遍對(duì)第一代至第四代頭孢類(lèi)、青霉素類(lèi)等藥物有90%以上的耐藥率,這為臨床用藥的選擇帶來(lái)很大困難。 經(jīng)過(guò)多年對(duì)恒河猴的飼養(yǎng)觀(guān)察發(fā)現(xiàn),恒河猴呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率高,嚴(yán)重時(shí)可引起死亡。 本文首次在恒河猴的肺組織中分離到陰溝腸桿菌,通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn),確定治療陰溝腸桿菌的首選藥物,為今后的臨床治療工作提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)雄性恒河猴1 只,8 歲,體重約7 kg。 健康KM 小鼠10 只,雌性,6 ～8 周齡。 恒河猴及KM小鼠均來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類(lèi)研究中心(恒河猴生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(滇) K2015-0004],使用許可證號(hào)[SYXK (滇)K2015-0006];KM 小鼠生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK (滇)K2014-0002],使用許可證號(hào)[SYXK (滇) K2014-0007])。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容經(jīng)本單位動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)審查通過(guò)(批準(zhǔn)號(hào):DWSP201902034),實(shí)驗(yàn)過(guò)程按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

SS 瓊脂(青島日水生物技術(shù)有限公司,批號(hào)20140522)、GN 增菌液(青島日水生物技術(shù)有限公司,批號(hào)20140215)、三糖鐵瓊脂(青島日水生物技術(shù)有限公司,批號(hào)20140331),ID 32 E 生化鑒定試條(梅里埃公司),藥敏紙片(北京天壇生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、ATB Expression 儀(法國(guó)梅里埃公司)。

圖1 恒河猴病變Figure 1 The lesions of rhesus monkey

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 病例資料

該恒河猴身體健康,由人工飼養(yǎng),每日喂以基礎(chǔ)飼料[5],自由飲水。 每日清洗猴籠,定期消毒。通過(guò)日常飼養(yǎng)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)該恒河猴表現(xiàn)為呼吸困難,精神沉郁,厭食,活動(dòng)減少等癥狀,立即轉(zhuǎn)入治療室單籠飼養(yǎng)及治療,靜脈輸液青霉素(80 萬(wàn)單位/次)3 d 后病情好轉(zhuǎn),停藥觀(guān)察,該猴精神及飲食情況并未完全恢復(fù)。 在治療室內(nèi)隔離觀(guān)察20 d 后放回大籠飼養(yǎng),于放回大籠第2 天死亡。 尸檢外觀(guān)可見(jiàn)腹部鼓氣(見(jiàn)圖1A),解剖心臟、肝、脾、胰腺、腎、腎上腺、膀胱未見(jiàn)異常,胃、腸管內(nèi)充氣(見(jiàn)圖1B),部分腸道呈出血性炎性變化,雙肺下呈充血、出血,邊緣部分肉樣肺炎病變(見(jiàn)圖1C)。

1.3.2 病料采集及培養(yǎng)

解剖柜條件下解剖死亡猴,用無(wú)菌手術(shù)剪切開(kāi)肺組織,用滅菌接種環(huán)在肉眼病變明顯和正常肺組織部位采樣,接種于GN 增菌液,在恒溫培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)增菌8 h 后,接種SS 瓊脂培養(yǎng)基,將平皿倒置放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 ～24 h 后觀(guān)察結(jié)果。

1.3.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

挑選SS 瓊脂培養(yǎng)基上典型菌落穿刺接種于三糖鐵瓊脂鑒別培養(yǎng)基,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h,作進(jìn)一步的分離培養(yǎng)和產(chǎn)酸產(chǎn)氣等培養(yǎng)特征的鑒定。 同時(shí)挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢。

1.3.4 細(xì)菌生化鑒定

細(xì)菌生化鑒定采用法國(guó)生物梅里埃公司ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及配套ID 32E 鑒定卡。 按照說(shuō)明書(shū),在鑒定卡中加入樣品后放37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),18 ～24 h 內(nèi)觀(guān)察生化反應(yīng)結(jié)果。 將反應(yīng)結(jié)果編號(hào)輸入ATB 鑒定系統(tǒng),判定結(jié)果。

1.3.5 藥敏試驗(yàn)

用紙片擴(kuò)散法,對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行常用抗菌類(lèi)藥物的敏感性試驗(yàn)。 平皿置于37℃培養(yǎng)24 h 后取出,觀(guān)察并測(cè)量抑菌圈直徑大小(mm)。 結(jié)果判定按美國(guó)CLSI 的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[6]。 所用8 種藥敏試紙片如下表。

表1 藥敏紙片及規(guī)格Table 1 Specification of drug-sensitive paper

1.3.6 病理檢查

取肉眼見(jiàn)明顯病變部位,4%甲醛溶液固定后制作病理切片,HE 染色,鏡檢。

1.3.7 小鼠致病性試驗(yàn)

用滅菌生理鹽水將分離純培養(yǎng)的細(xì)菌稀釋,ATB 比濁儀調(diào)整菌液濃度為4 McF。 設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組6 只小鼠,腹腔注射菌液0.5 mL/只,對(duì)照組4 只小鼠,腹腔注射滅菌生理鹽水0.5 mL/只。 記錄發(fā)病及致死情況,解剖死亡小鼠,記錄病理變化,無(wú)菌條件下采集肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 菌落特性

細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)在SS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成濕潤(rùn)、表面光滑、白色或乳白色、不透明的圓形菌落(如圖2A),革蘭氏染色鏡檢,可見(jiàn)革蘭氏陰性小桿菌(如圖2B)。

圖2 恒河猴肺組織分離菌菌落及菌體形態(tài)Figure 2 Colony and bacterial morphology from lung in rhesus monkey

2.2 生化特性

三糖鐵培養(yǎng)基分離培養(yǎng),該菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣。 將ID 32E 鑒定卡反應(yīng)結(jié)果編號(hào)輸入ATB 鑒定系統(tǒng),判定該細(xì)菌為陰溝腸桿菌, ID 為99.9%,T 為0.71,ID編碼35074753311,生化結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)

陰溝腸桿菌藥敏試驗(yàn)測(cè)得的抑菌圈直徑大小見(jiàn)表3。 從表中可看出該菌對(duì)氨芐西林、頭孢呋辛中等敏感;對(duì)諾氟沙星、阿米卡星、慶大霉素、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢噻肟敏感。

2.4 病理結(jié)果

肺部病變明顯部位制作病理切片,鏡檢可見(jiàn)肺內(nèi)炎性肉芽腫形成(圖3A),泡沫細(xì)胞聚集,血管支氣管周?chē)馨图?xì)胞浸潤(rùn)(圖3B)。

表2 細(xì)菌生化特性檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of biochemical characteristics

2.5 小鼠致病性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組小鼠于接種菌液后5 h 出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡、閉目、呼吸急促等臨床表現(xiàn),19 h 內(nèi)全部死亡,解剖可見(jiàn)肺葉出血、胃腸鼓氣、十二指腸腸壁變薄等病變(如圖4A、4B)。 取病變肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),分離出陰溝腸桿菌,表明該株陰溝腸桿菌對(duì)小鼠有較強(qiáng)的致病性。 對(duì)照組小鼠行為表現(xiàn)及剖檢情況均正常(如圖4C)。

3 討論

陰溝腸桿菌屬腸桿菌科腸桿菌屬,是條件致病菌,通常在人和動(dòng)物的腸道內(nèi)寄生。 如朱旗[7]等發(fā)現(xiàn)在賽馬腸道菌群中存在陰溝腸桿菌,黃小蘭[8]等從圈養(yǎng)滇金絲猴糞便中分離到陰溝腸桿菌。 近年來(lái)陰溝腸桿菌備受關(guān)注是因?yàn)槠湟l(fā)的呼吸系統(tǒng)感染疾病日益增多。 大量研究表明,某些嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病如燒傷、手術(shù)創(chuàng)傷、惡性腫瘤等,以及實(shí)施氣管切開(kāi)、導(dǎo)尿、靜脈插管等侵入性診療操作,都能破壞機(jī)體免疫屏障結(jié)構(gòu),造成免疫功能降低;另外激素等免疫抑制劑、化療藥物、抗生素的大量應(yīng)用及不適當(dāng)?shù)穆?lián)合用藥抑制了正常菌群,使機(jī)體內(nèi)的正常菌群大量減少,導(dǎo)致陰溝腸桿菌等條件致病菌增多并大量繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌種[9],并定位移植到腸外的其他器官系統(tǒng),感染部位主要是下呼吸道和泌尿道[10]。 目前,對(duì)人類(lèi)由陰溝腸桿菌引起的疾病研究較多,動(dòng)物方面也較常見(jiàn)。 如陰溝腸桿菌引起呼吸系統(tǒng)疾病的報(bào)道,包扣大熊貓呼吸道、七彩山雞肺臟、亞洲黑熊肺臟、綿羊肺部、牛肺臟感染[11-13];另有陰溝腸桿菌引起孔雀胚死亡、羅氏沼蝦幼蝦死亡、與馬鏈球菌獸疫亞種混合感染引起的馬出血性敗血癥等報(bào)道。 但未見(jiàn)恒河猴感染的有關(guān)報(bào)道。本文中該恒河猴由治療室轉(zhuǎn)出后突然死亡,可能是由于治療室與飼養(yǎng)大籠溫差較大,且突然改變環(huán)境引起的。 病理變化主要為呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng),與由陰溝腸桿菌單獨(dú)感染引起的綿羊肺炎的病理變化,如肺尖葉、心葉、隔葉呈不同程度的出血、充血及肝變,消化道表現(xiàn)為輕重不同的卡他性和出血性炎癥變化基本一致[14]。 恒河猴腹瀉及肺炎是常見(jiàn)病與多發(fā)病,嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。 本文從死亡恒河猴肺中分離到陰溝腸桿菌,這可能與恒河猴腹瀉時(shí)抵抗力下降以及不適當(dāng)?shù)氖褂脧V譜抗菌藥物,致使恒河猴體內(nèi)菌群失調(diào),導(dǎo)致陰溝腸桿菌從消化道移位到呼吸系統(tǒng)有關(guān)。 另外也可能與院內(nèi)獲得性感染有關(guān),隨著住院時(shí)間的延長(zhǎng),恒河猴與病原微生物接觸的機(jī)會(huì)增加,危重情況下更易感染陰溝腸桿菌。 因此入院后應(yīng)隔離治療,避免交叉感染。

陰溝腸桿菌與銅綠假單胞菌、鮑曼氏不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌是引起下呼吸道感染的主要革蘭陰性腸桿菌。 陰溝腸桿菌的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜,包括作用靶點(diǎn)的改變、主動(dòng)外排活躍和外膜蛋白缺失、整合子、qnr 基因介導(dǎo)、產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶等,其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶是腸桿菌科細(xì)菌最主要的耐藥機(jī)制。 長(zhǎng)期使用大量的抗菌藥物會(huì)引起細(xì)菌耐藥和交叉耐藥,造成臨床治療失敗,使臨床感染治療面臨潛在威脅[15-16]。 本研究中陰溝腸桿菌對(duì)8 種所試抗菌藥物均敏感,未出現(xiàn)耐藥的情況,這可能與治療時(shí)間較短有關(guān)系。 在我國(guó)獸醫(yī)臨床治療過(guò)程中,濫用抗菌藥物的現(xiàn)象極為普遍,僅憑經(jīng)驗(yàn)長(zhǎng)期大量的使用廣譜抗菌藥物會(huì)引起動(dòng)物體內(nèi)菌群失調(diào),導(dǎo)致陰溝腸桿菌感染及耐藥性的產(chǎn)生。 因此在實(shí)際工作中,為了有效控制該菌所致的各種感染,要做到以下幾點(diǎn):首先,采取有效的隔離措施,及時(shí)、正確治療嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病,做到早發(fā)現(xiàn)早隔離早治療;其次避免或縮短侵入性操作,降低陰溝腸桿菌侵入性感染的機(jī)率;同時(shí)加強(qiáng)抗菌藥物的流通管理工作,根據(jù)藥敏試驗(yàn)選用抗菌藥物,合理使用抗生素和激素,減少陰溝腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生;最后做到徹底消毒滅菌,避免陰溝腸桿菌的散播。

本研究中,從死亡恒河猴肺中分離到陰溝腸桿菌,該株陰溝腸桿菌對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致病性。 藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明陰溝腸桿菌對(duì)頭孢哌酮、頭孢噻肟最敏感,這為今后發(fā)現(xiàn)相同疾病的臨床治療工作提供一定的理論依據(jù)。

表3 陰溝腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Susceptibility test results of pneumonia pathogenic bacterium in rhesus monkey

圖3 恒河猴肺組織病理改變(HE 染色,× 100)Figure 3 Pathological changes of lung in rhesus monkey. HE staining

圖4 小鼠病變Figure 4 The lesions of mice