辣木籽水提物對酒精誘導(dǎo)線蟲運動功能障礙的影響

彭 穎

(長沙商貿(mào)旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410116)

長期大量飲酒不僅引起酒精嗜好性，而且影響機體代謝平衡。乙醇氧化分解產(chǎn)生大量乙醛及自由基，損傷肝胃等器官，還阻斷神經(jīng)信號的傳送，使機體的運動不協(xié)調(diào)、不受控制[1]，甚至酒精中毒。雖然藥物能緩解酒精毒性，但對機體會造成一定的負面作用，因此，天然植物提取物成為了學(xué)者們關(guān)注的熱點。

辣木籽是辣樹的種子，原產(chǎn)于印度，如今在亞洲、非洲、中美洲等地已被大規(guī)模種植。辣木籽因其營養(yǎng)豐富，已有直接食用或粗加工作為食品輔料的飲食史。研究表明，辣木籽含有豐富的揮發(fā)性油、維生素、黃酮、多酚、多糖、生物堿和皂苷等成分[2-3]，而且其水提液和醇提液具有抗氧化能力[4]，可以通過降低氧化應(yīng)激以抵抗炎癥反應(yīng)的發(fā)生[5]，能顯著降低乙醇誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化[6]。近年來，對辣木籽抗氧化能力的研究較多，但研究其解酒能力的較少，而且未見辣木籽水提物減弱酒精對運動神經(jīng)影響的文獻報道。黃穎等[7]研究發(fā)現(xiàn)辣木籽中的多酚物質(zhì)能顯著提升肝臟乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶活力，降低血液酒精濃度。但未從行為學(xué)及神經(jīng)代謝酶角度分析辣木籽的解酒水平。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)又稱為線蟲，其神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，功能完善，是神經(jīng)活性物質(zhì)靶標(biāo)測定的理想動物模型[8]。研究擬以線蟲為模式生物，研究辣木籽水提物對酒精脅迫運動功能障礙的影響，以期為辣木籽的解酒功效提供表征層面上的理論依據(jù)，促進辣木籽資源的開發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(E.coliOP50)、野生型秀麗隱桿線蟲(the Bristol strain N2)：國際線蟲遺傳中心；

辣木籽：云南元江縣蒼源林果科技有限公司；

無水乙醇、氯化鈣、氯化鈉、氫氧化鈉、硫酸鎂、蛋白胨、瓊脂、酵母粉等：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

5-氟尿嘧啶脫氧核苷(FUDR)：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；

乙酰膽堿酯酶(AchE)試劑盒：索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱：MJX-250B-Z型，上海博迅實業(yè)有限公司；

冷凍離心機：TGL-20M型，長沙英泰儀器有限公司；

倒置熒光顯微鏡：TS2R型，成貫儀器(上海)有限公司；

氣相色譜儀：6890N型，上海本昂科學(xué)儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：Multiskan FC型，濟南來寶醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 辣木籽剝皮后，種子經(jīng)干燥粉碎，過60目篩。以料液比1∶10 (g/mL)加入超純水，95 ℃浸提1 h，重復(fù)操作兩次，合并兩次濾液，經(jīng)濃縮后凍干備用。辣木籽水提物的提取效率為18.34%。

1.3.2 秀麗隱桿線蟲的同期化與培養(yǎng) 參照文獻[9]。用于試驗的線蟲采用液體培養(yǎng)(培養(yǎng)液即蟲液)，干預(yù)時蟲液的終濃度控制在(200±10)條/mL。為避免個體差異對試驗結(jié)果造成影響，秀麗隱桿線蟲經(jīng)同期化3次后，方能用于各指標(biāo)的檢測。

1.3.3 試驗分組及藥物處理 課題組[10]前期研究表明，在3%酒精濃度干預(yù)下，線蟲表現(xiàn)出醉酒的生理狀態(tài)，因此選用3%的酒精濃度進行醉酒線蟲的造模。

同期化后的線蟲生長至L4期，完成幼蟲階段最后一次蛻皮進入成蟲期時，加入終濃度為0.12 mmol/L的FUDR溶液，以抑制線蟲產(chǎn)卵及卵的孵出。12 h后，將蟲液分為等體積的6組至三角瓶中，分別為：A組(空白組)，B組(對照組，酒精濃度為3%)，C～F組為辣木籽水提物干預(yù)試驗組。辣木籽水提物粉末用3%酒精溶液溶解，并通過0.22 μm的過濾膜，使C～F組中辣木籽的終濃度分別為10，20，30，40 mg/mL，酒精濃度為3%。每組設(shè)3個平行。

1.3.4 線蟲頭部擺動頻率的測定 參照文獻[11-12]。在20 ℃下輕微震蕩培養(yǎng)24 h后分別吸取各組蟲液15 μL于NGM板上(每個板上線蟲數(shù)量為30條左右)，待線蟲恢復(fù)運動5 min后，在體視顯微鏡下觀察并記錄30 s內(nèi)每條線蟲頭部的擺動次數(shù)。線蟲頭部擺動頻率定義為線蟲頭部從一側(cè)擺向另一側(cè)，角度>90°記為擺動1次。

1.3.5 線蟲吞咽頻率的測定 在20 ℃下輕微震蕩培養(yǎng)24 h后分別吸取各組蟲液15 μL于NGM板上(每個板上線蟲數(shù)量為30條左右)，待線蟲恢復(fù)運動5 min后，在體視顯微鏡下觀察并記錄30 s內(nèi)每條線蟲的咽部吞咽次數(shù)，作為線蟲吞咽頻率的指標(biāo)[13]。

1.3.6 線蟲運動軌跡的測定 線蟲干預(yù)24 h后，移取10 μL 蟲液于沒有食物的NGM板上，讓其自由運動2 min，觀察各組線蟲在NGM板上的運動軌跡并拍照，收集線蟲運動軌跡的橫波和縱波波長，綜合分析各組線蟲的運動性能。

1.3.7 線蟲內(nèi)部酒精濃度的測定 采用氣相色譜法[14-15]。

(1) 預(yù)處理：線蟲干預(yù)結(jié)束后，于2 500 r/min離心2 min 收集蟲體，并用0.9%生理鹽水清洗蟲體3遍。再次離心去除上清液，用無菌水將蟲液重懸至1 mL，在冰水浴中進行超聲破碎(超聲3 s，間隔3 s，工作時間3 min)。于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清。在上清中加入終濃度為0.002%的正丁醇，樣品待測液經(jīng)0.22 μm 無機濾膜過濾后，上機待測。用同樣方法制備平行樣，供上機測試。

(2) 色譜條件：色譜柱為HP-INNO Wax毛細柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。柱溫60 ℃保持3 min，以10 ℃/min的升溫速率升至80 ℃，共6.5 min，檢測器溫度250 ℃；載氣(氮氣)流速1.2 mL/min；不分流模式，進樣量0.5 μL。

(3) 酒精標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：以0.002%的正丁醇作為內(nèi)標(biāo)，分別加入0.000 5%，0.001 0%，0.002 0%，0.003 0%，0.004 0% 終濃度的乙醇標(biāo)品，進行標(biāo)曲的制作。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=25 036X-0.058 2，R2=0.999 7。

1.3.8 線蟲鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、乙酰膽堿酯酶的測定 線蟲在干預(yù)24 h后，處理方式同1.3.7(1)。用M9清洗蟲體3遍，在冰水浴下進行細胞破碎，提取蛋白提取液，用于鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、乙酰膽堿酯酶的檢測。檢測方法參照試劑盒說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木籽水提物對線蟲頭部擺動頻率的影響

由圖1可知，對照組線蟲的頭部擺動頻率顯著低于空白組(P<0.05)，說明線蟲在3%酒精濃度干預(yù)下，酒精阻礙線蟲頭部的擺動，導(dǎo)致線蟲處于酒精脅迫的狀態(tài)。相比對照組，藥物組(C～F)的線蟲頭部擺動頻率隨辣木籽水提物濃度的增加呈下降的趨勢，當(dāng)辣木籽水提物濃度達到40 mg/mL(F組)時線蟲的頭部運動受到限制，與對照組無顯著差異(P>0.05)，說明辣木籽水提物濃度過高對線蟲頭部擺動有限制作用；當(dāng)辣木籽水提物濃度為10 mg/mL(C組)時線蟲的頭部運動較對照組有顯著提高(P<0.05)，說明低濃度的辣木籽水提物能保護線蟲的擺頭運動。

2.2 辣木籽水提物對線蟲吞咽頻率的影響

在液體培養(yǎng)環(huán)境中，線蟲會保持不斷吞咽的狀態(tài)。造模后，線蟲體內(nèi)的酒精濃度較高，會麻痹神經(jīng)元，導(dǎo)致其陷入昏睡狀態(tài)，逐漸減慢吞咽頻率。從圖2可以看出，對照組的線蟲在酒精的干預(yù)下，吞咽速度顯著減緩(P<0.05)，相比空白組線蟲的正常吞咽速度下降了41.45%。而加入低濃度辣木籽水提物(10，20 mg/mL)的線蟲較對照組吞咽次數(shù)明顯增加(P<0.05)，且在10 mg/mL水提物作用下的線蟲的吞咽次數(shù)是對照組的1.46倍。說明低濃度的辣木籽水提物可以緩解酒精對線蟲的麻痹作用，緩解酒精誘導(dǎo)線蟲昏睡、停止進食的狀態(tài)。

低濃度(10 mg/mL)的辣木籽水提物對線蟲的頭部擺動運動及吞咽運動均能起到保護作用，減弱酒精導(dǎo)致線蟲的運動障礙。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，辣木籽能明顯改善認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)元損傷，對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用。因此，這可能與辣木籽水提物能保護運動神經(jīng)有關(guān)。

2.3 辣木籽水提物對線蟲運動能力的影響

由圖3可知，線蟲正常的運動軌跡為一條徑直的正弦波長(A組)，而B組中線蟲受酒精的影響，其運動能力受到抑制，無法正常擺動身體，運動曲線趨向于平緩，無明顯的波峰。說明酒精能在一定程度上阻礙線蟲的正常運動，使線蟲拖尾爬行。而C組(10 mg/mL)線蟲的運動軌跡基本和正常情況下的線蟲保持一致，但隨著辣木籽水提物添加濃度的增大，線蟲的運動能力并沒有得到恢復(fù)。說明低濃度的辣木籽水提物可以減少酒精對線蟲運動能力的抑制，在整體上保護線蟲免受酒精的損傷。而高濃度的辣木籽水提物則不能協(xié)助線蟲恢復(fù)運動能力，無法抵抗酒精損傷。Sousa等[17]報道了經(jīng)高溫處理的高、低濃度的辣木籽提取物對線蟲毒害作用及其對線蟲運動性的影響。高濃度的辣木籽提取物經(jīng)高溫處理后，對線蟲的毒害作用以及對線蟲運動性的影響與未經(jīng)高溫處理組對比，沒有顯著性差異。而低濃度的五味子提取物經(jīng)高溫處理后，其對線蟲致死率以及對線蟲運動性的影響顯著降低，致死率降低40%，抑制線蟲運動的能力降低10%左右。因此，高濃度的辣木籽提取物不能保護線蟲的正常生理活性，使線蟲運動不活躍。而低濃度的提取物卻沒有明顯的負面作用。

圖1 各試驗組線蟲的頭部擺動頻率

圖2 各試驗組線蟲的咽泵運動頻率

2.4 線蟲組織內(nèi)部乙醇濃度

檢測了線蟲在酒精或辣木籽水提物組干預(yù)24 h后，其體內(nèi)乙醇積累的濃度，檢測結(jié)果如圖4所示。各辣木籽水提物組線蟲的體內(nèi)乙醇濃度較對照組的均顯著下降(P<0.05)，但隨著辣木籽水提物濃度的增大，線蟲體內(nèi)積累的乙醇濃度又逐漸升高。其中10 mg/mL辣木籽水提物組較對照組來說，線蟲體內(nèi)乙醇濃度下降了63.95%，而40 mg/mL辣木籽水提物組線蟲體內(nèi)乙醇濃度僅比對照組下降了12.98%。說明低濃度的辣木籽水提物有助于線蟲減少乙醇在體內(nèi)的積累。但高濃度的辣木籽水提物不能有同樣的效果，可能是由于線蟲在攝入食物的同時也在攝入酒精，而辣木籽水提物對線蟲有一定的量效關(guān)系，濃度過高會降低線蟲的代謝活力，導(dǎo)致其體內(nèi)的酒精無法及時被代謝。

圖3 各試驗組線蟲的運動軌跡圖

2.5 線蟲體內(nèi)神經(jīng)相關(guān)酶活力

酒精攝入后，打破了機體的正常代謝，引起線蟲體內(nèi)相關(guān)酶活的變化。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)在細胞信號傳遞中直接受Ca2+的調(diào)節(jié)，參與神經(jīng)信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)機體在運動中對刺激的適應(yīng)過程[18]。如圖5(a)所示，對照組與空白組相比，酒精的刺激，顯著提高了線蟲體內(nèi)CaN的酶活力(P<0.05)。而在低濃度辣木籽水提物(10，20 mg/mL)干預(yù)下，線蟲體內(nèi)的CaN的酶活力處于動態(tài)平衡，與空白組無顯著性差異(P>0.05)，但較對照組顯著降低了CaN酶活力(P<0.05)。

圖4 各試驗組線蟲組織內(nèi)部的乙醇濃度

線蟲的背、腹神經(jīng)索存在著神經(jīng)—肌肉突觸，由興奮性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)來調(diào)節(jié)肌肉活動[19]。乙酰膽堿酯酶(AchE)是一種關(guān)鍵性酶，可水解Ach，維持正常的肌肉生理效應(yīng)[20]。如圖5(b)所示，對照組與空白組相比，線蟲AchE酶活力顯著降低(P<0.05)，下降了40.38%；低濃度辣木籽水提物組(10 mg/mL)線蟲的AchE酶活力雖低于空白組的(P<0.05)，但顯著高于對照組的(P<0.05)，提高了48.63%。

研究[21-22]發(fā)現(xiàn)酒精的攝入，使線蟲體內(nèi)酒精積累過多，刺激CaN的過表達，且抑制了AchE的酶活力。這可能是由于外源酒精的刺激，Ca2+離子通道被打開，造成Ca2+大量外流入胞漿，Ca2+在胞漿中的濃度升高，激活了CaN的酶活性，從而CaN活性升高。CaN具有促進神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)、肌肉組織發(fā)育的作用，增強了Ach釋放到肌肉組織中。然而酒精抑制了AchE酶活力，因此無法及時分解Ach，會引起神經(jīng)—肌肉接頭處Ach下降，使運動神經(jīng)—肌肉興奮沖動受阻，導(dǎo)致運動能力的下降。而低濃度的辣木籽水提物通過減少酒精在線蟲體內(nèi)的積累，以降低外來刺激，維持鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶酶活力的動態(tài)平衡，并有效激活了乙酰膽堿酯酶的酶活性，能及時清除突觸間隙—肌肉中堆積的Ach，維持著較高的生物活性，使得生理信息得以正確的傳遞，因而線蟲能快速適應(yīng)外來環(huán)境，保持正常的生理運動。

圖5 各試驗組線蟲體內(nèi)神經(jīng)相關(guān)酶的活力

3 結(jié)論

水提物試驗從表征指標(biāo)、體內(nèi)酒精濃度積累以及2種神經(jīng)調(diào)節(jié)相關(guān)酶活性方面證實，低濃度的辣木籽水提物能在一定程度上保護線蟲免受酒精的刺激，具有緩解酒精毒性的作用。但未能明晰具體的作用物質(zhì)，且未深入到基因水平去挖掘作用機制。因此，下一階段可進一步研究水提物的具體成分，以及對運動神經(jīng)通路的影響，并深入研究辣木籽水提物各組分對機體內(nèi)部的整體調(diào)控作用，探尋作用靶點調(diào)節(jié)機體的整體代謝水平的機制。