超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆芽中恩諾沙星、環(huán)丙沙星殘留量的不確定度評定

施元旭 張水鋒 潘項捷 馮婷婷 王璐璐

(浙江方圓檢測集團股份有限公司，浙江 杭州 310018)

豆芽品種豐富，營養(yǎng)全面，深受百姓喜愛。但豆芽需要在濕度較高的環(huán)境中才能發(fā)芽[1]，而高濕度的環(huán)境又容易造成豆芽的根部潰爛腐敗。同時，不良商家為了追求豆芽的生產(chǎn)速率和豆芽的外表品質(zhì)，會在豆芽的生長過程中非法添加抗生素類藥物[2-3]、殺菌劑[4-5]等對人體有害的物質(zhì)，使得“毒豆芽”的問題層出不窮。如噴灑恩諾沙星和環(huán)丙沙星藥劑，其主要目的是為了防止根部腐爛。從食品安全角度來看，豆芽中殘留的恩諾沙星和環(huán)丙沙星會對人體產(chǎn)生一定的危害，長期使用將對人體造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害[6-8]。

恩諾沙星和環(huán)丙沙星屬于化學合成的喹諾酮類抗菌藥物，具有光譜抗菌活性，對革蘭氏陰性菌有很強的殺滅作用[9-11]。但長期食用有恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留的豆芽，會導致人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)嚴重的功能性疾病。嚴重時，可使人出現(xiàn)肌無力或呼吸肌無力進而危害生命，且還具有一定的遺傳性和致癌性[12]。

評定測量結(jié)果的不確定度可以保證檢測結(jié)果更加準確，同時，通過不確定度的評價也可以判定試驗結(jié)果質(zhì)量的高低。因此，不確定度的評價是實驗室質(zhì)量體系的重要組成部分[13-15]。目前，較多文獻[16-18]報道研究豆芽中有恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢出，但中國還未制定豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量檢測的國家標準或行業(yè)標準。試驗擬采用酸化乙腈提取，過prime HLB柱凈化，氮吹濃縮前處理方法，應(yīng)用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留量進行測定。依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》和JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》評定豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量檢測的不確定度，有助于為豆芽品質(zhì)評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆芽：市售；

恩諾沙星、環(huán)丙沙星：德國Dr.Ehrenstorfer公司；

恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8：北京Bepure公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國Meker公司；

甲酸：色譜純，美國ROE Scientific公司；

超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent 1290-AB Sciex 5500型，美國AB Sciex公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 稱取5.0 g豆芽于50 mL高速離心管中，準確加入內(nèi)標工作液，渦旋混合均勻。加入10 g氯化鈉，渦旋混勻，再加入8 mL乙腈，20 μL甲酸，渦旋混合1 min，振蕩提取10 min。高速冷凍離心后，取上清液過prime HLB小柱，并直接接取流出液。樣品過柱后，用2 mL 乙腈淋洗小柱。接取流出液在40 ℃條件下N2吹干，1.0 mL初始流動相定容，過膜上機測試。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱：Aglient RRHD SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫35 ℃；流動相A：乙腈；流動相B：0.1%甲酸水；流速0.2 mL/min；進樣量5 μL；液相色譜梯度洗脫程序：0～1 min，90% B；1.0～3.0 min，90%～10% B；3.0～3.5 min，10% B；3.5～5.0 min，10%～90% B；5.0～6.0 min，90% B。

1.2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧(ESI)離子源：正離子模式；掃描模式：多反應(yīng)檢測(MRM)；噴霧電壓5.0 kV；脫溶劑氣溫度550 ℃；氣簾氣壓力241 kPa；霧化氣壓力345 kPa。其他參數(shù)見表1。

表1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的主要質(zhì)譜參數(shù)?

1.2.4 數(shù)學模型

(1)

式中：

X——樣品中恩諾沙星或環(huán)丙沙星的含量，μg/kg；

C——樣品中恩諾沙星或環(huán)丙沙星測定濃度，μg/L；

V——提取液的定容體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

fr——待測物質(zhì)的回收率，%；

fQ——液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜校正影響因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的不確定度來源

根據(jù)試驗檢測步驟和建立的數(shù)學模型，超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量的不確定度主要有以下幾個方面：① 測試過程隨機效應(yīng)引入的不確定度urel(X)；② 稱樣量引入的不確定度urel(m)；③ 樣品定容引入的不確定度urel(V)；④ 標準曲線擬合的不確定度urel(curve)；⑤ 標準溶液配制的不確定度urel(c)；⑥ 回收率測試過程隨機效應(yīng)的不確定度urel(fr)；⑦ 儀器分析的不確定度urel(fQ)。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 測試過程隨機效應(yīng)引入的不確定度urel(X) 包括樣品制備過程的均勻性、樣品提取液和定溶液的濃度和純度、電子天平的穩(wěn)定性、移液器和容量瓶定容等因素引入的不確定度。

平行測定6份樣品(n=6)，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，結(jié)果見表2。用貝塞爾公式[式(2)～(4)]計算，單個測得值的標準偏差、標準不確定度及相對標準不確定度。

(2)

(3)

(4)

表2 測試過程隨機效應(yīng)引入的不確定度urel(X)計算結(jié)果

2.2.4 標準曲線擬合引入的不確定度urel(curve) 配制5個不同質(zhì)量濃度的標準溶液繪制標準曲線，每個濃度點的標準溶液分別重復(fù)測定3次，以標準溶液濃度Xi(μg/L)為橫坐標，以標準溶液外標峰面積值(A外標)與內(nèi)標峰面積值(A內(nèi)標)的比值為縱坐標，用最小二乘法擬合，線性回歸方程以及線性相關(guān)系數(shù)R2見表3。

分別重復(fù)測定樣品溶液6次(p=6)，計算線性回歸方程導致x0的標準不確定度

(5)

urel(curve)=u(curve)/x0，

(6)

式中：

S——標準曲線的標準偏差；

x0——樣品溶液平均濃度，μg/L；

b——斜率；

a——截距；

n——測試標準溶液的試驗總次數(shù)(每個標準溶液點測試3次×5個不同質(zhì)量濃度的點)，n=15。

計算結(jié)果見表4。

2.2.5 標準溶液配制過程引入的不確定度urel(c) 標準溶液配制過程引入的不確定度主要包括恩諾沙星、環(huán)丙沙星標準品的純度、標準品稱量和定容，標準溶液稀釋定容、標準曲線配制引入的不確定度。

(1) 原始標準物質(zhì)引入的不確定度：恩諾沙星的純度為99.9%，標準不確定度為1.25%，取包含因子k=2，其相對標準不確定度u(P1)=1.25%/2=0.006 25，urel(P1)=0.006 25/0.999=0.006 256。環(huán)丙沙星的純度為92.31%，標準不確定度為0.66%，取包含因子k=2，相對標準不確定度u(P2)=0.66%/2=0.003 3，urel(P2)=0.003 3/0.923 1=0.003 575。

恩諾沙星內(nèi)標的純度為95.3%，標準不確定度為1%，取包含因子k=2，相對標準不確定度u(P3)=1%/2=0.005，urel(P3)=0.005/0.953=0.005 247。環(huán)丙沙星內(nèi)標的純度為(94.8±1.0)%，標準不確定度為1%，取包含因子k=2，相對標準不確定度u(P4)=1%/2=0.005，urel(P4)=0.005/0.948=0.005 274。

恩諾沙星標準物質(zhì)純度和內(nèi)標物質(zhì)純度合成相對不確定度為：

環(huán)丙沙星標準物質(zhì)純度和內(nèi)標物質(zhì)純度合成相對不確定度為：

表3 恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

表4 urel(curve)計算結(jié)果

內(nèi)標物質(zhì)均為10 mg，一次性溶解，不存在由于稱量而產(chǎn)生的不確定度。

(3) 標準儲備液定容引入的不確定度：標準儲備液定容引入的不確定度來源分別為定容液的體積膨脹引入的不確定度和10 mL容量瓶引入的不確定。

恩諾沙星標準溶液稀釋引入的合成相對不確定度為：

同理，環(huán)丙沙星標準溶液稀釋引入的合成相對不確定度為：urel(c環(huán)3)=0.012 01。

恩諾沙星內(nèi)標溶液稀釋引入的合成相對不確定度為：

同理，環(huán)丙沙星內(nèi)標溶液稀釋引入的合成相對不確定度為：urel(c環(huán)4)=0.011 99。

10 mL容量瓶定容引入的不確定度，可根據(jù)2.2.5(3)的計算方法，得到的相對不確定度urel(c10 mL)=0.003 283。

配制恩諾沙星標準曲線引入的合成相對不確定度：

樣品中添加恩諾沙星內(nèi)標引入的合成相對不確定度：

因此，配制環(huán)丙沙星標準曲線引入的相對不確定度urel(c環(huán)5)=0.056 31；樣品中添加環(huán)丙沙星內(nèi)標引入的相對不確定度urel(c環(huán)6)=0.012 01。

標準曲線稀配制過程和樣品中添加內(nèi)標引入的合成相對不確定度為：

urel(c環(huán))=0.060 67。

2.2.6 回收率測試過程隨機效應(yīng)引入的不確定度urel(fr) 由于目標化合物從樣品基質(zhì)中不能完全提取出來，加上提取、氮吹過程的損失導致了較大的不確定度，對樣品前處理產(chǎn)生的不確定度用回收率方法來計算。

按照方法的要求對同一個樣品重復(fù)加標6次(n=6)，上機測定恩諾沙星和環(huán)丙沙星的加標回收率，結(jié)果見表5。根據(jù)式(7)計算得到6次試驗結(jié)果的標準偏差s(X)，式(8)計算得到回收率測試過程中引入的相對不確定度。

(7)

(8)

表5 urel(fr)計算結(jié)果

2.2.7 檢測儀器引入的不確定度urel(fQ) 由《超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜 儀器校準證書》知，urel(fQ)=2%。

2.3 合成不確定度

恩諾沙星和環(huán)丙沙星的相對不確定度分量表見表6，若不考慮各不確定度的相關(guān)性，則其合成不確定度按式(9) 計算。

(9)

通過式(9)求得：urel(W恩)=0.087 08；urel(W環(huán))=0.104 2。

2.4 擴展不確定度及結(jié)果表示

根據(jù)CNAS-GL006:2018《化學分析中不確定度的評估指南》，取包含因子k=2(95%置信度)時，擴展不確定度U=urel(W)×2×X，由此得到豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的測量結(jié)果，見表7。

表6 恩諾沙星和環(huán)丙沙星相對不確定度分量

表7 豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星不確定度評定結(jié)果

3 結(jié)論

試驗以豆芽為研究對象，采用0.1%酸化乙腈提取，prime HLB固相萃取小柱凈化，應(yīng)用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法對豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留量進行測定。根據(jù)數(shù)學模型，對豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量的不確定度各分量進行評定，評定結(jié)果表明，測定結(jié)果的不確定度最主要來源于標準曲線的擬合和標準溶液的配置過程，其次是儀器的影響和回收率，其他因素的影響較小。因此，試驗過程中，需要操作人員增加試驗的平行次數(shù)以及標準溶液的測定次數(shù)，維護好檢測儀器的性能，使其有足夠的靈敏度和精密度，定期做好儀器期間核查和校準檢定，減少因儀器引入的不確定度。定期對恩諾沙星和環(huán)丙沙星的標準溶液期間核查，保證標準物質(zhì)的可靠性，從而保證試驗結(jié)果的準確可靠。同樣，稱量樣品時，可考慮選取精度更高的電子天平，或增加稱樣量，來減少稱樣過程引入的不確定度，從而提高試驗結(jié)果的準確度。