10種殺菌劑對馬鈴薯黑脛病主要致病菌的室內(nèi)毒力

馮志文，曹亞寧，孫清華，李文思，吳 健，張若芳

（內(nèi)蒙古大學馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070）

馬鈴薯黑脛病被認為是影響馬鈴薯生產(chǎn)最重要的細菌性病害之一，在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生[1,2]。近年來，隨著馬鈴薯種植面積的不斷擴大，輪作倒茬困難，種薯與產(chǎn)地間流通頻繁，導(dǎo)致黑脛病發(fā)生面積日趨擴大，在中國北方一作區(qū)、西南混作區(qū)、中原二作區(qū)和南方冬作區(qū)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)均有不同程度的發(fā)生[3-5]，且有逐年加重的趨勢，已經(jīng)嚴重威脅馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。該病從出苗到生長后期均可發(fā)生，以苗期最盛，主要侵染主莖和塊莖的維管束組織，嚴重時引起缺苗斷壟和塊莖腐爛，造成產(chǎn)量與品質(zhì)大幅降低，通常發(fā)病率在2%～5%，嚴重時可達40～50%[6]。

據(jù)報道，目前造成馬鈴薯黑脛病的主要致病菌為果膠桿菌屬（Pectobacterium spp.）和狄基氏菌屬（Dickeya spp.）的細菌。研究表明，以黑腐果膠桿菌（P.atrosepticum）（Pa）[7]、胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種（P. carotovorum subsp. brasiliensis）（Pcb）[8]和胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（P. carotovorum subsp.carotovorum）（Pcc）[9]3 種致病菌引起的黑脛病最為普遍，除此之外，還有P.odoriferum、P.parmentieri[10]、P. peruviense[11]、 P. polaris[12]、 P. punjabense[13]、D. chrysanthemi、D. dianthicola、D. zeae、D. dadantii、D. paradisiaca 和D. solani[14-16]均可引起馬鈴薯黑脛病，致病菌越來越復(fù)雜。中國馬鈴薯黑脛病的主要病原是Pa[17-21]，近年來部分地區(qū)也發(fā)現(xiàn)有Pcb[22]和Pcc[23]引起的黑脛病發(fā)生。

目前，中國馬鈴薯生產(chǎn)中對黑脛病的防治主要以預(yù)防為主[24,25]，采用合格種薯、輪作以及化學防治等措施，其中藥劑防治仍是采用的主要方法。藥劑防治方法雖然簡單快捷，但是目前關(guān)于該病的藥劑防治的研究尚少，田間試驗篩選的幾種藥劑在實際生產(chǎn)中的防控效果不佳。因此，有必要從主要致病菌入手，篩選出防治馬鈴薯黑脛病的有效藥劑。本文測定了10種殺菌劑對3種馬鈴薯黑脛病菌的室內(nèi)毒力，篩選出最佳防治藥劑及其使用濃度，旨在為生產(chǎn)用藥提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

馬鈴薯黑脛病菌（Pectobacterium spp.）：從包頭市達茂旗采集馬鈴薯病株分離得到的黑腐果膠桿菌（P.atrosepticum）（Pa），從張家口市張北縣采集馬鈴薯病株分離得到的胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種（P. carotovorum subsp. brasiliensis）（Pcb），從固原市原州區(qū)采集馬鈴薯病株分離得到的胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（P. carotovorum subsp. carotovorum）（Pcc），經(jīng)分子生物學鑒定與致病性測定，保存于內(nèi)蒙古大學植物病理實驗室。

1.2 供試培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基）。

1.3 供試藥劑

50%氯溴異氰尿酸可溶粉劑（河北上瑞生物科技有限公司）、21%中生·乙酸銅可濕性粉劑（福建凱立生物制品有限公司）、46%氫氧化銅水分散粒劑（美國杜邦公司）、30%琥膠肥酸銅懸浮劑（河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司）、40%噻唑鋅懸浮劑（浙江新農(nóng)化工股份有限公司）、1.5%噻霉酮水乳劑（陜西西大華特科技實業(yè)有限公司）、2%春雷霉素水劑（江門市植保有限公司）、1%香菇多糖水劑（北京三浦百草綠色植物制劑有限公司）、3%氨基寡糖素水劑（河南三浦百草生物工程有限公司）和100萬孢子/g寡雄腐霉可濕性粉劑（捷克生物制劑股份有限公司）。

1.4 測定方法

采用抑菌圈法開展試驗。用無菌水將已培養(yǎng)好的供試菌株配置成濃度為107cfu/mL 的懸浮液，取200 μL均勻涂抹在NA培養(yǎng)基平板上。用無菌水將各供試藥劑分別配成有效成分含量為0.10%、1.00%、10.00%（有效成分含量不足10.00%時以藥劑最高有效成分含量計）3種濃度，將直徑6 mm的無菌濾紙片在配置好藥劑中完全浸濕，在超凈臺中風干，置于涂有病原菌的平板中央，每皿1片。在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，采用十字交叉法測量抑菌圈的直徑。以無菌水浸沒濾紙片作為對照，每個處理重復(fù)3次，初步篩選出對3種病原菌有效的供試藥劑。

在已篩選的供試藥劑基礎(chǔ)上，根據(jù)美國國家臨床實驗室標準化委員會藥物敏感實驗判定標準，從低濃度到高濃度篩選出抑菌圈直徑＞10 mm（中度敏感）的藥劑進一步開展毒力比較。每種供試藥劑設(shè)置6～7個濃度，有效成分含量高于10.00%的藥劑用無菌水分別配置成有效成分含量為0.50%、1.00%、1.25%、2.50%、5.00%和10.00%6個濃度，有效成分含量為2.00%的藥劑用無菌水分別配置成有效成分含量為0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%和2.00%6個濃度，有效成分含量為1.50%的藥劑用無菌水分別配置成有效成分含量為0.05%、0.10%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%和1.50% 7 個濃度。經(jīng)培養(yǎng)后，按照上面的方法，測量抑菌圈的直徑。每個處理重復(fù)3次，以無菌水為對照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用以下公式計算抑制率（%）：

抑制率（%）=（處理抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑）/（處理抑菌圈直徑）×100

式中，對照抑菌圈直徑為無菌濾紙片的直徑。

以藥劑濃度的對數(shù)（x）為自變量，以抑制率的機率值（y）為因變量，建立毒力回歸方程，求出各藥劑的致死中濃度（EC50），比較供試藥劑對3種致病菌的毒力。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌劑對馬鈴薯黑脛病菌的抑制作用

通過室內(nèi)初步毒力測定表明，10種供試殺菌劑中有6種對馬鈴薯黑脛病菌有抑制作用，其他4種無抑制作用（圖1）。由圖1可知，氯溴異氰尿酸可溶粉劑、中生·乙酸銅可濕性粉劑、氫氧化銅水分散粒劑、噻霉酮水乳劑和琥膠肥酸銅懸浮劑在含量高于1.00%時對3種馬鈴薯黑脛病菌Pa、Pcb和Pcc均表現(xiàn)出較好的抑制效果，抑菌圈直徑均在8.8 mm以上。春雷霉素水劑在含量高于1.00%時對馬鈴薯黑脛病菌Pa和Pcc均表現(xiàn)出較好的抑制效果，抑菌圈直徑分別在12.0和15.5 mm以上，但對Pcb沒有抑制作用。值得說明的是，噻霉酮水乳劑在含量0.10%時，對Pa也能表現(xiàn)出較好的抑制效果，平均抑菌圈直徑達到8.5 mm。

在考慮殺菌劑有效性的基礎(chǔ)上，充分考慮殺菌劑的成本與田間可操作性等因素，并根據(jù)美國國家臨床實驗室標準化委員會藥物敏感實驗判定標準，從低濃度到高濃度篩選出抑菌圈直徑＞10 mm（中度敏感）的殺菌劑進一步開展室內(nèi)毒力測定。依此標準篩選出的6種殺菌劑對3種黑脛病菌Pa、Pcb和Pcc的抑制效果（圖2），認為50%氯溴異氰尿酸可溶粉劑、2%春雷霉素水劑和1.5%噻霉酮水乳劑對馬鈴薯黑脛病菌Pa有效，46%氫氧化銅水分散粒劑、30%琥膠肥酸銅懸浮劑和50%氯溴異氰尿酸可溶粉劑對馬鈴薯黑脛病菌Pcb有效，2%春雷霉素水劑、21%中生·乙酸銅可濕性粉劑、46%氫氧化銅水分散粒劑和1.5%噻霉酮水乳劑對馬鈴薯黑脛病菌Pcc 有效，并進一步開展接下來的毒力測定。

2.2 不同殺菌劑對馬鈴薯黑脛病菌的毒力測定

由表1可知，隨著有效成分濃度的增加，2%春雷霉素水劑、50%氯溴異氰尿酸可溶粉劑和1.5%噻霉酮水乳劑3種殺菌劑均表現(xiàn)出對Pa的抑制作用逐漸增強，抑菌圈逐漸增大。2%春雷霉素水劑對Pa的EC50值

為8.63 μL/mL，在濃度為10.0 μL/mL時抑菌圈為15.8 mm，抑制率達到62.1%，顯著高于低藥劑濃度對Pa的抑制作用，并隨著有效成分濃度的增加，各藥劑濃度對Pa的抑制作用開始不明顯，直至濃度達到20.0 μL/mL時，對Pa的抑制作用才顯著提高，即至多稀釋2倍才能有較好地抑制效果。50%氯溴異氰尿酸可溶粉劑對Pa的EC50值為14.11 μL/mL，在濃度為25.0 μL/mL時，抑菌圈為16.2 mm，抑制率為62.9%，并隨著有效成分濃度的增加，各藥劑濃度對Pa的抑制作用差異顯著，即稀釋5～20倍后就可達到較好地抑制效果。1.5%噻霉酮水乳劑對Pa 的EC50值為2.17 μL/mL，在濃度為5.0 μL/mL時抑菌圈為15.7 mm，抑制率達到61.7%，并隨著有效成分濃度的增加，各藥劑濃度對Pa的抑制作用并未顯著增加，即至多稀釋3倍才能有較好的抑制效果。

由表2可知，隨著有效成分濃度的增加，46%氫氧化銅水分散粒劑、30%琥膠肥酸銅懸浮劑和50%氯溴異氰尿酸可溶粉劑3種殺菌劑同樣表現(xiàn)為對Pcb的抑制作用逐漸增強，抑菌圈逐漸增大。3種殺菌劑對Pcb的EC50值分別為3.63，8.06和14.69 μL/mL。盡管46%氫氧化銅水分散粒劑的EC50值很低，但其濃度在5.0 μL/mL 時的抑菌圈僅為12.2 mm，抑制率也僅為50.7%，隨著氫氧化銅濃度的提高，濃度為100.0 μL/mL 時抑菌圈為19.7 mm，抑制率達到69.5%，明顯高于其他藥劑濃度處理，表明只有加大殺菌劑的施用量（即低稀釋倍數(shù)，4.6倍）才能有較好地抑制效果。30%琥膠肥酸銅懸浮劑和50%氯溴異氰尿酸可溶粉劑也表現(xiàn)出與46%氫氧化銅水分散粒劑對Pcb相似的抑制規(guī)律，即高藥劑濃度時才有較好的抑制效果，在濃度為100.0 μL/mL時，抑菌圈分別為17.5和30.0 mm，抑制率分別達到65.7%和80.0%。

2%春雷霉素水劑、46%氫氧化銅水分散粒劑、21%中生·乙酸銅可濕性粉劑和1.5%噻霉酮水乳劑4種殺菌劑隨著有效成分濃度的增加，表現(xiàn)為對Pcc的抑制作用逐漸增強，抑菌圈逐漸增大（表3）。2%春雷霉素水劑對Pcc的EC50值為4.75 μL/mL，在濃度為7.5 μL/mL 時抑菌圈為15.5 mm，抑制率達到61.3%，并隨著有效成分濃度的增加，抑制作用增

強，但直到15.0 μL/mL時才出現(xiàn)顯著差異，即至多稀釋2.7倍才能有較好地抑制效果。46%氫氧化銅水分散粒劑和21%中生·乙酸銅可濕性粉劑對Pcc 的EC50值分別為1.18和6.75 μL/mL，但其只有在高藥劑濃度時才有明顯地抑制效果，在濃度為100.0 μL/mL時，抑菌圈分別為22.7和26.0 mm，抑制率分別達到73.5%和76.9%。1.5%噻霉酮水乳劑對Pcc的EC50值為0.21 μL/mL，在濃度僅為5.0 μL/mL時抑菌圈就達到21.0 mm，抑制率達到71.4%，并隨著有效成分濃度的增加至7.5 μL/mL后各藥劑濃度對Pcc的抑制作用并未顯著增加，因此，稀釋2～3倍才能取得較好的抑制效果。

表1 3種殺菌劑對馬鈴薯黑脛病菌Pa的室內(nèi)毒力測定Table 1 Toxicity measurement of different concentrations of bactericides to Pa

表2 3種殺菌劑對馬鈴薯黑脛病菌Pcb的室內(nèi)毒力測定Table 2 Toxicity measurement of different concentrations of bactericides to Pcb

綜上所述，篩選出的有效藥劑只有在高濃度（即稀釋2～20倍）時，才能發(fā)揮出較好的抑制效果。氯溴異氰尿酸可溶粉劑、氫氧化銅水分散粒劑和噻霉酮水乳劑具有廣譜性，對3 種馬鈴薯黑脛病菌Pa、Pcb、Pcc均表現(xiàn)出較好的抑制效果。中生·乙酸銅可濕性粉劑和琥膠肥酸銅懸浮劑雖也具廣譜性，但中生·乙酸銅可濕性粉劑對Pcc抑制效果更佳，而琥膠肥酸銅懸浮劑則對Pcb的抑制效果更佳。春雷霉素水劑僅對馬鈴薯黑脛病菌Pa 和Pcc均表現(xiàn)出較好的抑制效果，但對Pcb沒有抑制作用。

表3 4種殺菌劑對馬鈴薯黑脛病菌Pcc的室內(nèi)毒力測定Table 3 Toxicity measurement of different concentrations of bactericides to Pcc

3 討 論

銅制劑中的銅離子可與病原菌細胞膜表面上的K+、H+等陽離子進行交換，造成病原菌細胞膜上的蛋白質(zhì)凝固；也可滲透進入病原菌細胞內(nèi)與某些酶結(jié)合，影響酶活性[26]，因此，銅制劑殺菌劑是一種良好的保護性殺菌劑，在中國馬鈴薯黑脛病防治中使用較多。據(jù)報道，馬鈴薯播種前采用30%琥膠肥酸銅懸浮劑400倍液進行浸種對馬鈴薯黑脛病的防效達到75%以上[6]。每隔7～10 d 50%琥膠肥酸銅濕性粉劑或95%乙酸銅水劑500倍葉面噴施一次，噴施2～3次，也可有效防治黑脛病的發(fā)生[27]。馬鈴薯噴施40%可殺得（氫氧化銅）600～700倍液可顯著降低了冬作區(qū)馬鈴薯黑脛病的發(fā)病率，防效顯著[28]。室內(nèi)毒力測定也證實，30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑和56.7%氫氧化銅水分散粒劑對黑脛病菌Pa有一定的防效，僅為45%和46%[29]。本研究也表明，氫氧化銅水分散粒劑和琥膠肥酸銅懸浮劑則對3種黑脛病菌均有抑制作用，且琥膠肥酸銅懸浮劑對Pcb的抑制效果更佳。無論是氫氧化銅水分散粒劑還是琥膠肥酸銅懸浮劑，只有有效成分濃度高于2.50%（即稀釋12～20倍以下）時，抑制率才能達到60%以上。通常，銅制劑在田間應(yīng)用濃度較低，且施用后受外界環(huán)境與植株狀態(tài)影響較大，這可能是其在田間應(yīng)用效果欠佳的主要原因之一。

氯溴異氰尿酸可溶粉劑經(jīng)溶解后葉面噴施到作物表面，會緩慢釋放出次溴酸，具有強烈地殺滅細菌、真菌的能力，不僅造成病原菌細胞死亡，還可封閉植物傷口。經(jīng)過內(nèi)吸傳導(dǎo)釋放次溴酸后的母體形成三嗪二酮和均三嗪還具有強烈的殺病毒作用。氯溴異氰尿酸可溶粉劑對多種作物多種真細菌病以及病毒病具有較好地防治效果[30]，但在馬鈴薯病害的防治上未見報道。本研究表明，氯溴異氰尿酸可溶粉劑對3種馬鈴薯黑脛病菌Pa、Pcb、Pcc均表現(xiàn)出較好的抑制效果，在高的藥劑濃度時，抑制率可達80%以上。在保證馬鈴薯正常生長的情況下，該藥劑在田間對抑制黑脛病菌侵染的效果如何還需進一步研究。另外，氯溴異氰尿酸雖能殺死病原菌，但其也可能殺死其他植物內(nèi)生有益菌，并可能對植株產(chǎn)生一定的傷害，在這方面也需進一步研究。

噻霉酮是近年來研制的一種新型的廣譜性殺菌劑，據(jù)報道，其主要通過破壞病原菌的細胞核結(jié)構(gòu)，干擾病原菌細胞的新陳代謝，致使病原菌因生理紊亂而死亡[31]。室內(nèi)毒力測定指出3%噻霉酮懸浮劑對馬鈴薯黑脛病菌Pa的抑制效果較好，EC50值為38.18 μg/mL[32]。本研究表明，1.5%噻霉酮水乳劑不僅對馬鈴薯黑脛病菌Pa的抑制效果較好，EC50值為2.17 μL/mL，而且對黑脛病菌Pcb、Pcc（EC50值為0.21 μL/mL）也有一定的抑制效果。盡管噻霉酮在室內(nèi)毒力測定中對黑脛病菌表現(xiàn)出良好的抑制效果，但其在田間如何施用以及防治效果如何還需進一步研究。

春雷霉素和中生菌素等農(nóng)用抗生素主要通過抑制細菌蛋白質(zhì)的合成而廣泛用來防治作物細菌性病害[33]。室內(nèi)抑菌圈測定表明，2%春雷霉素可濕性粉劑對黑脛病菌Pa 的抑制效果較好，EC50值為5.27 μL/mL[29]。本研究則認為，春雷霉素水劑對馬鈴薯黑脛病菌Pa 和Pcc 均表現(xiàn)出較好的抑制效果，EC50值分別為8.63和4.75 μL/mL，而對Pcb沒有抑制作用。這表明，春雷霉素對黑脛病菌的抑制具有一定的選擇性，在生產(chǎn)中應(yīng)用時要注意病原菌的種類。孫彥敏[32]認為，3%中生菌素對黑脛病菌Pa的抑制效果較差，EC50值為445 μg/mL。本研究中，中生·乙酸銅可濕性粉劑具廣譜性，總體抑制效果一般，對Pcc抑制效果更佳，這可能是中生菌素抑制蛋白質(zhì)合成與乙酸銅中銅離子共同發(fā)揮作用的結(jié)果。

在田間馬鈴薯黑脛病發(fā)病初期，若能快速準確地對致病菌進行分離鑒定，就可有針對性的選擇有效的藥劑進行防治，做到精準施藥。本研究表明，可選擇50%氯溴異氰尿酸可溶粉劑、2%春雷霉素水劑和1.5%噻霉酮水乳劑防治馬鈴薯黑脛病菌Pa，選擇46%氫氧化銅水分散粒劑、30%琥膠肥酸銅懸浮劑和50%氯溴異氰尿酸可溶粉劑防治馬鈴薯黑脛病菌Pcb，選擇2%春雷霉素水劑、46%氫氧化銅水分散粒劑、21%中生·乙酸銅可濕性粉劑和1.5%噻霉酮水乳劑防治馬鈴薯黑脛病菌Pcc。然而，目前還沒有建立起馬鈴薯黑脛病致病菌快速檢測體系，從病株取樣到分離鑒定至少需要5～7 d，這無疑拖延了黑脛病防治的有效時間。因此，在田間剛出現(xiàn)黑脛病病株時，建議選擇對3種馬鈴薯黑脛病致病菌具有廣譜性的殺菌劑。根據(jù)本研究結(jié)果，氯溴異氰尿酸、氫氧化銅、琥膠肥酸銅、中生·乙酸銅和噻霉酮對3種黑脛病菌Pa、Pcb、Pcc具有較好的抑制效果，具有相對廣譜性，建議在田間進一步驗證后選擇施用。