hrHPV E6/E7 mRNA載量水平與宮頸癌前病變的相關(guān)性分析

郭晨輝 徐小晶 孔薇 項(xiàng)敏

宮頸癌前病變即宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是有癌變傾向，在數(shù)年至數(shù)十年期間有可能發(fā)展為宮頸癌的病變［1-2］。已有研究顯示［3-4］，高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus，hrHPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌變的主要危險(xiǎn)因素，宮頸癌患者中hrHPV 陽(yáng)性率高達(dá)85%～90%。HPV 基因組包括早期區(qū)、晚期區(qū)和非編碼區(qū)，其中早期區(qū)基因E6 和E7 可以參與病毒自身的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程，在宮頸癌變中發(fā)揮了最主要的作用，可用于宮頸癌的鑒別診斷［5］。既往研究采用定性檢測(cè)分析了hrHPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性表達(dá)與CIN 和宮頸癌之間的關(guān)系，及其對(duì)CIN和宮頸癌的鑒別診斷［6］。但hrHPV E6/E7 mRNA 載量對(duì)CIN 的診斷價(jià)值，及其與CIN 病變程度之間的關(guān)系報(bào)道較少。因此，本研究定量分析了hrHPV E6/E7 mRNA 載量與CIN 病變之間的關(guān)系，旨在為宮頸癌的預(yù)防和治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016年12月到2019年6月本院確診的176 例宮頸病變患者，其中CIN 組144 例，宮頸癌組32例。CIN 組患者年齡25～60 歲，平均（40.87±7.62）歲，經(jīng)產(chǎn)婦98 例，未產(chǎn)婦46 例，根據(jù)CIN 分級(jí)［7］：CINⅠ級(jí)62 例，CINⅡ級(jí)45 例，CINⅢ級(jí)37 例。宮頸癌組患者年齡28～60 歲，平均（42.53±8.46）歲，經(jīng)產(chǎn)婦24 例，未產(chǎn)婦8 例。另取同期50 例慢性宮頸炎患者為慢性宮頸炎組，年齡25～60 歲，平均（40.54±8.21）歲，經(jīng)產(chǎn)婦32 例，未產(chǎn)婦18 例。3 組間的年齡、經(jīng)產(chǎn)次比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)陰道鏡下組織病理學(xué)檢查和宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)（thinprep cytology test，TCT）檢測(cè)確診，符合《宮頸癌防治指南》中CIN 和宮頸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］；均未經(jīng)接受過(guò)放化療治療，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期、月經(jīng)期或哺乳期患者；存在宮頸手術(shù)史；入組前2 周內(nèi)服用相關(guān)抗病毒藥物；合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤患者；合并其它免疫系統(tǒng)疾病者；臨床資料不完整者。

1.2 方法

①檢查前3 d 不能性生活、陰道用藥或陰道沖洗，避開(kāi)月經(jīng)期。將TCT 專用刷伸入子宮頸內(nèi)，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5 周，收集宮頸脫落上皮細(xì)胞，置于采樣瓶中，用于TCT、hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7mRNA 檢測(cè)。②TCT 檢測(cè)：使用全自動(dòng)細(xì)胞制片機(jī)制片，參考2001年TBS 分級(jí)系統(tǒng)［9］，包括NSIL：無(wú)上皮病變或惡性改變；ASC-H：不典型鱗狀細(xì)胞；ASC-US：意義不明的非典型鱗狀細(xì)胞；LSIL：低級(jí)別鱗狀CIN；HSIL：高級(jí)別鱗狀CIN；SCC：鱗狀細(xì)胞癌。③hrHPV DNA 檢測(cè)：采用第二代捕獲雜交法（hybrid capture-Ⅱ，HC-Ⅱ）（美國(guó)凱杰公司）檢測(cè)13 種hrHPV DNA 表達(dá)，相對(duì)光單位/臨床閾值（relative light units/cut off，RLU/CO）表示HPV 病毒載量，重復(fù)檢測(cè)2 次取均值。④hrHPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)：采用支鏈DNA（Branched-DNA，bDNA）信號(hào)擴(kuò)增法（科蒂亞生物技術(shù)公司）檢測(cè)14 種hrHPV E6/E7 mRNA 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。重復(fù)檢測(cè)2 次取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料均以（±s）表示，單因素方差分析比較多組間差異，SNK-q比較多組兩兩間差異；ROC 分析hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA載量對(duì)CIN 的診斷價(jià)值；Pearson 相關(guān)性分析hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量與CIN 病變程度之間的相關(guān)性；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者的hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA 載量比較

CIN 組和宮頸癌組患者的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量高于慢性宮頸炎組（P＜0.05），CIN 組患者的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量低于宮頸癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組患者的hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA載量比較（±s）Table 1 Comparison of hrHPV E6/E7mRNA and hrHPV DNA load in each group（±s）

表1 各組患者的hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA載量比較（±s）Table 1 Comparison of hrHPV E6/E7mRNA and hrHPV DNA load in each group（±s）

注：與慢性宮頸炎組相比，aP＜0.05；與宮頸癌組相比，bP＜0.05。

組別CIN 組宮頸癌組慢性宮頸炎組F 值P 值n 144 21 50 hrHPV DNA［lg（RLU/CO）］1.76±0.55ab 2.12±0.70a 1.44±0.46 14.871＜0.001 hrHPV E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］3.04±0.96ab 4.21±1.34a 1.86±0.61 60.372＜0.001

2.2 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量對(duì)CIN 的診斷價(jià)值

hrHPV E6/E7 mRNA 在CIN 與慢性宮頸炎鑒別診斷中AUC 為0.816，95%CI為0.719～0.913，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），hrHPV DNA 載量在CIN與慢性宮頸炎鑒別診斷中AUC 為0.561，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P＞0.05）；hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量在CIN 與宮頸癌鑒別診斷中AUC 分別為0.736 和0.698，95%CI分別為0.664～0.808 和0.615～0.780，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.3 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量與宮頸細(xì)胞學(xué)TBS 分級(jí)的關(guān)系

隨著TBS 分級(jí)增加，hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量呈升高趨勢(shì)（P＜0.05），HSIL 組和宮頸癌組的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA載量高于ASC 組、LSIL 組和NSIL 組；ASC 組和LSIL 組 的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量高于NSIL 組（P＜0.05）。宮頸癌組和HSIL 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），ASC 組和LSIL 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量與TBS 分級(jí)的關(guān)系（±s）Table 2 relationship between hrHPV E6/E7 mRNA and hrHPV DNA load and TBS grading（±s）

表2 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量與TBS 分級(jí)的關(guān)系（±s）Table 2 relationship between hrHPV E6/E7 mRNA and hrHPV DNA load and TBS grading（±s）

注：與NILM 相 比，aP＜0.05；與ASC 相比，bP＜0.05；與LSIL 相比，cP＜0.05。

TBS 分級(jí)NILM ASC LSIL HSIL SCC F 值P 值n 90 24 59 32 21 hrHPV DNA［lg（RLU/CO）］1.40±0.38 1.77±0.56a 1.82±0.57a 2.21±0.72abc 2.25±0.71abc 87.274＜0.001 hrHPV E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］1.65±0.52 3.42±1.08a 3.54±1.12a 4.21±1.24abc 4.33±1.40abc 146.539＜0.001

2.4 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量與CIN 病變程度的關(guān)系

隨著CIN 分級(jí)增加，hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量呈升高趨勢(shì)（P＜0.05），CINⅢ級(jí)患者的hrHPV E6/E7 mRNA 載量高于CINⅠ和CINⅡ期（P＜0.05），CINⅡ級(jí)的hrHPV E6/E7 mRNA 載量高于CINⅠ（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA 載量與CIN 病變程度的關(guān)系（±s）Table 3 relationship between hrHPV E6/E7mRNA and hrHPV DNA load and the degree of CIN lesions（±s）

表3 hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA 載量與CIN 病變程度的關(guān)系（±s）Table 3 relationship between hrHPV E6/E7mRNA and hrHPV DNA load and the degree of CIN lesions（±s）

注：與CINⅠ級(jí)相比，aP＜0.05；與CINⅡ級(jí)相比，bP＜0.05。

CIN 分級(jí)CIN Ⅰ級(jí)CIN Ⅱ級(jí)CIN Ⅲ級(jí)）F 值P 值n 62 45 37 hrHPV DNA［lg（RLU/CO）］1.52±0.48 1.78±0.53a 2.03±0.65ab 10.460＜0.001 hrHPV E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］2.01±0.62 3.24±1.02a 4.12±1.13ab 66.826＜0.001

2.5 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量與CIN 病變程度之間的相關(guān)性關(guān)系

Pearson 相關(guān)性分析顯示，hrHPV E6/E7 mRNA和hrHPV DNA 載量均與CIN 病變程度呈正相關(guān)（r=0.285，0.621；P＜0.05）。

3 討論

CIN 是宮頸非典型增生，hrHPV 持續(xù)感染是導(dǎo)致CIN 發(fā)展為宮頸癌的最主要因素。既往研究常采用hrHPV 感染來(lái)輔助臨床宮頸癌的篩查，靈敏度高，可以作為宮頸癌初篩工具之一［10］。然而近年來(lái)研究顯示［11］，只有宮頸上皮細(xì)胞的hrHPV 持續(xù)性感染可能誘發(fā)宮頸癌變，而單純一過(guò)性hrHPV 感染很難誘導(dǎo)宮頸惡性腫瘤的形成。hrHPV 持續(xù)感染受HPV 病毒的亞型、癌基因活躍程度、宿主免疫應(yīng)答等多種因素影響，單純的hrHPV 檢測(cè)無(wú)法區(qū)分hrHPV 的感染狀態(tài)，對(duì)于宮頸病變的診斷、嚴(yán)重程度評(píng)估具有一定的局限性［12］。HPV 基因組的調(diào)控功能主要由E 區(qū)基因（E1、E2、E4、E5、E6 和E7）編碼，其中E6 基因編碼的E6 蛋白可以調(diào)節(jié)癌基因p53 的表達(dá)，發(fā)揮致癌作用，而E7 基因編碼的蛋白可以降解Rb，釋放E2F 轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)細(xì)胞惡性增殖［13］。Fan 等的研究顯示［14］，E6/E7 基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯是調(diào)節(jié)HPV 感染誘導(dǎo)宮頸癌變的重要基因，可以反映病毒癌基因的活性，在宮頸癌篩查中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究定量分析了hr-HPV E6/E7 mRNA 載量與CIN 病變之間的關(guān)系，旨在準(zhǔn)確評(píng)估CIN 的發(fā)生發(fā)展，預(yù)防宮頸癌變的發(fā)生。

本研究中，CIN 組患者的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 水平明顯高于慢性宮頸炎組，且低于宮頸癌組，提示hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 水平與患者的宮頸癌變有關(guān)，有望應(yīng)用于臨床診斷。本研究中，隨著TBS 分級(jí)增加，hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量呈上升趨勢(shì)。TBS 分級(jí)是一種基于宮頸/陰道細(xì)胞學(xué)的診斷技術(shù)，根據(jù)宮頸細(xì)胞病變程度進(jìn)行分級(jí)，在宮頸癌篩查中具有較高的特異性，但敏感性較低［15］。本研究結(jié)果提示hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量與宮頸細(xì)胞病變程度有關(guān)，有望應(yīng)用于臨床宮頸病變的評(píng)估。

綜上所述，hrHPV E6/E7 mRNA 對(duì)CIN 具有較高的診斷價(jià)值，且mRNA 載量與CIN 分級(jí)具有顯著的相關(guān)性，可以用于CIN 的鑒別診斷和病變?cè)u(píng)估，指導(dǎo)臨床預(yù)防和治療工作的進(jìn)行。本研究不足之處在于樣本數(shù)量較少，且為單中心研究，可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差，但本研究仍為CIN 的診斷和防治提供了一定的理論依據(jù)。