聚多巴胺改性自支撐碳纖維固定化酶研究

蘇麗訪 王翠娥 蔡再生 趙亞萍

東華大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó))

相比于化學(xué)類催化劑，酶作為一種重要的生物催化劑，具有高效、專一、反應(yīng)條件綠色等優(yōu)異的特點(diǎn)[1-3]。然而，由于游離態(tài)酶催化活性低、穩(wěn)定性較差，且不易于后續(xù)的分離回收，因此限制了其在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用?；诰G色、經(jīng)濟(jì)及可持續(xù)化學(xué)的研究發(fā)展考慮，當(dāng)前研究熱點(diǎn)已轉(zhuǎn)向采用生物催化劑固定化技術(shù)來合成高立體選擇性和對(duì)應(yīng)選擇性的產(chǎn)物，這可以在一定程度上很好地改善游離酶的上述不足。目前研究中，載體材料對(duì)固定化酶工程的影響較大，目前在眾多學(xué)者的研究中，多糖、天然高分子、無機(jī)材料及有機(jī)聚合物等載體材料被廣泛應(yīng)用于固定化酶的研究中，但是這些材料仍然存在著各種缺點(diǎn)，如尺寸較大、結(jié)構(gòu)不易調(diào)控、力學(xué)性能差、使用壽命較短等[4]。碳材料因其三維立體結(jié)構(gòu)而具有較大的比表面積、有序的孔結(jié)構(gòu)、良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，這些優(yōu)良性質(zhì)可以克服上述缺點(diǎn)，在固定化酶領(lǐng)域充當(dāng)優(yōu)良的載體[5-7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸多巴胺，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸，無錫市亞盛化工有限公司；考馬斯藍(lán)G250，上海瀚思化工有限公司；棕櫚酸對(duì)硝基苯酯，百靈威科技有限公司；無水碳酸鈉，天津市北辰方正試劑廠；脂肪酶Lipozyme CALB，丹麥諾維信Novozymes；無水乙醇，無錫市亞盛化工有限公司；磷酸二氫鉀，無錫市亞盛化工有限公司；磷酸氫二鉀，無錫市亞盛化工有限公司，三聚氰胺泡沫，南京漢雄科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，上海衡平儀器儀表廠；多功能磁力攪拌器，金壇市杰瑞爾電器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；磁力攪拌器，上海志威電器有限公司；真空管式爐，合肥科晶材料技術(shù)有限公司；水浴恒溫振蕩器，金壇市杰瑞爾電器有限公司；pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；搖床，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；掃描電子顯微鏡(SEM)，日本電子株式會(huì)社；紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.3 聚多巴胺改性碳纖維固定化酶的制備

1.3.1 碳纖維的制備

將長(zhǎng)10 cm、寬5 cm、高1 cm的三聚氰胺泡沫放置在干凈的載玻片上，將放置有三聚氰胺泡沫的載玻片放入管狀升溫爐中，升溫至400 ℃，在此溫度下煅燒1 h后獲得碳纖維。

1.3.2 聚多巴胺改性碳纖維的制備

在20 mL磷酸緩沖液中(pH值為8.5)加入50 mg碳纖維載體(10塊，每塊質(zhì)量為5 mg)，超聲分散30 min，然后加入鹽酸多巴胺(2 mg/mL)常溫?cái)嚢? h。反應(yīng)完成后，用磷酸緩沖溶液(pH值為8.5)和乙醇多次洗滌反應(yīng)產(chǎn)物，然后在40 ℃真空干燥箱內(nèi)干燥8 h。所得產(chǎn)物即為聚多巴胺改性后的碳纖維。

1.3.3 聚多巴胺改性碳纖維固定化酶的制備

稱取一定量的聚多巴胺改性后的碳纖維載體，加入脂肪酶溶液(質(zhì)量濃度為1 mg/L)中，然后于30 ℃下在轉(zhuǎn)速為120 r/min 的搖床內(nèi)反應(yīng)5 h。固定化反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖液(0.1 mol/L， pH值為7.0)多次洗滌以除去未結(jié)合的脂肪酶。同時(shí)，將反應(yīng)液與洗滌液合并用于后續(xù)殘留酶量的測(cè)定。所得固定化酶經(jīng)室溫自然干燥后，存放于4 ℃冰箱內(nèi)以備后用。

1.4 測(cè)試與表征

1.4.1 固定化脂肪酶酶載的測(cè)定

1.4.1.1 試驗(yàn)原理

測(cè)量固定化酶含量采用考馬斯亮藍(lán)法，原理是利用蛋白質(zhì)能夠和染料結(jié)合，蛋白含量不同而顯示出不同的顏色[12-13]。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合的反應(yīng)速率較快，2 min內(nèi)即可反應(yīng)完全，反應(yīng)產(chǎn)物可以穩(wěn)定1 d?？捡R斯亮藍(lán)和蛋白質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物在595 nm 處具有最大吸收波長(zhǎng)，且在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)與吸光度成正比，符合朗伯比爾定律。該法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的重復(fù)性好，靈敏度高，線性關(guān)系較好，干擾物質(zhì)較少，可作為一種快速靈敏的定量測(cè)量微量蛋白質(zhì)濃度的方法[14-15]。

載體上固定化的酶蛋白含量可采用式(1)計(jì)算。

(1)

式中：Ae——酶載量(mg/g)；

Co——固定化前酶液質(zhì)量濃度(mg/L)；

C——固定化后酶液質(zhì)量濃度(mg/L)；

v——固定化酶所用的酶溶液體積(mL)；

Cw——洗滌固定化酶后緩沖溶液中酶溶液的質(zhì)量濃度(mg/L)；

vw——洗滌固定化酶所用的緩沖溶液的體積(mL)；

W——碳泡沫的質(zhì)量(g)。

1.4.1.2 Bradford工作液的配制

首先將25 mL乙醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%)、50 mL磷酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%)和87.5 mg考馬斯亮藍(lán)試劑混合，配置Bradford儲(chǔ)存液，在棕色瓶中于4 ℃下保存。然后將蒸餾水、磷酸、乙醇和Bradford儲(chǔ)存液按體積比為425∶15∶30∶30混合，再用濾紙過濾，然后將工作液放入棕色瓶中于4℃下保存，待用。

1.4.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用pH為7.0的磷酸緩沖液配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 mg/mL的脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，按順序分別取0.3 mL標(biāo)準(zhǔn)酶溶液于4 mL離心管中，再加入3 mL的Brodford儲(chǔ)存液在室溫下反應(yīng)5 min，于595 nm處測(cè)吸光度。以0.3 mL磷酸緩沖液(pH為7.0)和3 mL Brodford儲(chǔ)存液混合作為此次測(cè)試的空白對(duì)照組。所得數(shù)據(jù)以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)擬合得酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 酶活力測(cè)定

在一定條件下，硝基苯酚棕櫚脂溶液可以被脂肪酶水解。試驗(yàn)采用硝基苯酚棕櫚脂溶液和脂肪酶反應(yīng)5 min，取其水解產(chǎn)物稀釋至一定的倍數(shù)后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)得波長(zhǎng)為410 nm處的數(shù)值，用以表征產(chǎn)物的質(zhì)量濃度，即可得出脂肪酶的酶活[16-17]。

對(duì)硝基苯酚棕櫚脂溶液的配制：按14.41 mol/L的濃度配制，稱取0.125 9 g的對(duì)硝基苯酚棕櫚脂，置于25 mL的小燒杯中，加入無水乙醇，攪拌使其溶解。待完全溶解后轉(zhuǎn)入25 mL的容量瓶中，用無水乙醇定容，低溫保存，備用。底物溶液的配制：將1 mL的對(duì)硝基苯酚棕櫚脂和1 mL的磷酸緩沖液(0.05 mol/L， pH值為7.0)混合，振蕩使其充分混合，得到黃色的懸浮液。

將自由酶或固定化酶加入底物溶液中，置于一定溫度的恒溫水浴振蕩器上反應(yīng)，同時(shí)用秒表計(jì)時(shí)。5 min后取出，立即加入2 mL碳酸鈉溶液(0.5 mol/L，)，以中止反應(yīng)。然后用離心機(jī)在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min。取出0.5 mL反應(yīng)液置于小燒杯中，用去離子水稀釋10倍，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在410 nm處的吸光度。同時(shí)在不加酶的條件下，對(duì)底物溶液進(jìn)行相同的處理，用所得的空白試樣作為紫外測(cè)試的基線。在此反應(yīng)液中對(duì)硝基苯酚棕櫚脂的摩爾吸光系數(shù)為14.5×10-3L/(mol·cm)。

一個(gè)脂肪酶的活力單位對(duì)應(yīng)于在檢測(cè)條件下，每分鐘反應(yīng)體系生成1 μmol的對(duì)硝基苯酚棕櫚脂量。固定化酶的活性定義為每克固定化酶的活性力單位數(shù)：

式中：Ac——固定化酶的活性[μmol/(L·g)]；

A——410 nm處的吸光度值；

a——反應(yīng)被稀釋的倍數(shù)，本試驗(yàn)中a=20；

V——反應(yīng)液的總體積(mL)，本試驗(yàn)中V=2 mL；

ε——對(duì)硝基苯酚棕櫚脂的摩爾吸光系數(shù)，具體數(shù)值為14.5×10-3L/(mol·cm)；

I——比色皿的厚度(cm)，本試驗(yàn)中I=1 cm；

t——水解時(shí)間(min)，本試驗(yàn)中t=5 min；

m——固定化酶的質(zhì)量(g)。

相對(duì)酶活=(每組中酶活力值/該組中最高酶活力值)×100%

1.4.3 固定化酶的穩(wěn)定性

分別在不同溫度、pH值和儲(chǔ)存時(shí)間條件下測(cè)定固定化酶和游離酶的酶活力，評(píng)價(jià)固定化酶的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚多巴胺改性碳纖維的SEM分析

聚多巴胺改性前后碳纖維的SEM圖如圖1所示。由圖1可以看出，改性前后的碳纖維均呈現(xiàn)出三維立體結(jié)構(gòu)，經(jīng)測(cè)量可知纖維直徑為30～40 μm。由圖1a)可以看出，未改性的碳纖維表面較光滑。由圖1b)可以看出，聚多巴胺改性后的碳纖維表面存在顆粒狀物質(zhì)，且改性后纖維粗糙度明顯增加，纖維表面被一層聚多巴胺膜包覆，說明聚多巴胺已成功在碳纖維上產(chǎn)生自聚。

a) 改性前

2.2 固定化脂肪酶蛋白含量

脂肪酶質(zhì)量濃度分別為0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6和0.7 mg/mL時(shí)，根據(jù)7組測(cè)試數(shù)據(jù)擬合得的酶標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。由圖2可知，有6個(gè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)都位于線性方程上，表明其滿足方程擬合條件。所得方程為Y=1.286 79X-0.015 86，該方程是計(jì)算酶載的基礎(chǔ)。

圖2 酶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

配制固定化酶液的質(zhì)量濃度Co=2 mg/mL，其他數(shù)據(jù)見表2，其中C=1.588 mg/mL，Cw=0.061 mg/mL，v=50 mL，vw=25 mL，W=0.125 g，計(jì)算可得固定化脂肪酶的酶載Ae=153 mg/g。這一高酶載量歸因于碳纖維的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大大增加了載體的比表面積，使載體和酶的接觸面積增大，發(fā)生反應(yīng)的幾率高。此外，聚多巴胺改性后碳纖維的表面官能團(tuán)增加，其與脂肪酶發(fā)生席夫堿反應(yīng)，使酶固定在碳纖維上，固定化酶的相對(duì)活性增加，使得酶載量較高[18-21]。

2.3 游離酶及固定化酶酶學(xué)性質(zhì)對(duì)比分析

2.3.1 溫度對(duì)酶活性的影響

溫度對(duì)游離酶和固定化酶活性的影響如圖3所示。由圖3可以看出，在一定的溫度范圍內(nèi)(20～70 ℃)，隨著溫度的升高，游離酶和固定化酶的酶活均呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，且游離酶和固定化酶的酶活力均在30 ℃達(dá)最大值。但在30～70 ℃的范圍內(nèi)，固定化酶表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。溫度為70 ℃時(shí)，游離酶的酶活性僅為7%，而固定化酶的酶活性仍達(dá)52%。其原因可能是發(fā)生共價(jià)結(jié)合后的固定化酶被穩(wěn)定地固定在載體的小區(qū)域內(nèi)，因此在較高的溫度下仍能維持蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并繼續(xù)進(jìn)行酶催化反應(yīng)，保持較高的酶活性。

圖3 溫度對(duì)酶活性的影響

2.3.2 pH值對(duì)酶活性的影響

pH值對(duì)游離酶和固定化酶活性的影響如圖4所示。由圖4可以看出，在一定的pH值范圍內(nèi)(5～9)，固定化酶和游離酶的活性隨著pH值的變化呈現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)。當(dāng)pH值為5～7時(shí)，游離酶和固定化酶的活性均隨著pH值的增大而增大，pH值為7時(shí)活性均達(dá)最大值，可知游離酶和固定化酶試驗(yàn)的反應(yīng)pH值均為7。隨著pH值的進(jìn)一步增大，在pH值為7～9范圍內(nèi)，游離酶和固定化酶的活性均隨著pH值的增大而減小，當(dāng)pH為9時(shí)，游離酶的活性僅為39%，而固定化酶的活性仍可達(dá)75%。說明固定化酶可在更寬的pH值范圍內(nèi)保持較高的活性。原因可能是游離酶體系中，pH值的微小變化即會(huì)導(dǎo)致酶活性中心的基團(tuán)離子化，從而明顯降低酶的活性，而聚多巴胺改性后載體表面的羥基和氨基有pH緩沖作用，使脂肪酶微環(huán)境的變化小于溶液環(huán)境的變化，尤其是當(dāng)pH值較高時(shí)，聚多巴胺改性載體上的羥基和氨基在pH值變化時(shí)，可保持酶分子處于較穩(wěn)定的pH環(huán)境中，從而使脂肪酶的酸堿穩(wěn)定性得以改善。

圖4 pH值對(duì)酶活性的影響

2.3.3 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)酶活性的影響

固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性對(duì)其實(shí)際應(yīng)用具有重要的意義。圖5為固定化酶和游離酶在保存不同時(shí)間后呈現(xiàn)出的活性變化。

圖5 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)酶活性的影響

從圖5可以看出，固定化酶和游離酶的活性均隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷下降，但游離酶的活性下降更明顯。當(dāng)儲(chǔ)存時(shí)間達(dá)9 d時(shí)，游離酶的活性僅為初始活性的18%，而固定化酶的活性仍可達(dá)到初始活性的43%，說明脂肪酶經(jīng)固定化后，儲(chǔ)存穩(wěn)定性明顯提高。這是因?yàn)檩d體對(duì)脂肪酶具有很好的保護(hù)作用，同時(shí)酶與載體之間的相互作用可使酶分子之間的剛性增強(qiáng)，因而儲(chǔ)存穩(wěn)定性明顯提高。

3 結(jié)論

本文采用三聚氰胺泡沫制備出聚多巴胺改性自支撐碳纖維載體。該聚多巴胺改性自支撐碳纖維載體可直接用于共價(jià)固定化脂肪酶，碳纖維改性過程在pH值為8.5的反應(yīng)條件下進(jìn)行，反應(yīng)條件綠色溫和，可避免使用具有生物毒性的試劑連接酶和載體。試驗(yàn)結(jié)果表明，聚多巴胺改性復(fù)合材料具有高負(fù)載量和生物相容性，對(duì)目標(biāo)酶親和力強(qiáng)。與游離酶相比，所得固定化酶具有良好的環(huán)境穩(wěn)定性和條件適用性。總體而言，本試驗(yàn)制備的聚多巴胺改性碳纖維復(fù)合材料對(duì)脂肪酶固定化的成功應(yīng)用，展示了其在固定化酶工程領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。