兒童重癥感染產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌耐藥及耐藥基因分析

邱海燕 吳軍華

寧波市婦女兒童醫(yī)院兒科（浙江寧波 315012）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是最常見的產超廣譜β-內酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）臨床分離菌。由于不同地區(qū)用藥情況不同，產ESBLs菌的耐藥情況也有明顯地區(qū)差異，加強對耐藥菌耐藥性的檢測十分迫切[1]。為了解兒童重癥感染產ESBLs KP的耐藥和耐藥基因的攜帶情況，本研究對連續(xù)3 年的兒科重癥監(jiān)護室臨床分離KP 耐藥監(jiān)測進行回顧性分析。

1 臨床資料

回顧分析寧波市婦女兒童醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護病房和新生兒重癥監(jiān)護病房2016 年7 月—2019 年6 月收治并診斷為重癥感染患兒的臨床資料，將其痰液、咽拭子、糞便、尿液、血液和膿液等標本，按照《全國臨床檢驗操作規(guī)范》進行接種、細菌培養(yǎng)與分純，用VITEK2 COMPACT全自動微生物分析儀進行KP菌株的鑒定。

共有143例重癥感染患兒分離出KP，其中男性86例、女性57 例，中位年齡1.5 月齡。分離的143 株KP主要來自呼吸道標本，共117株（81.8%），其中又以痰液標本居多，為105株，另12株為咽拭子標本；來自糞便標本8株（5.6%），血液標本5株（3.5%），尿液3株（2.1%），膿液3株（2.1%）以及其他標本7株（4.9%）。

采取美國臨床和實驗室標準化委員會（CLSI）推薦的表型確證方法（紙片擴散法）進行ESBLs 表型確證試驗。頭孢噻肟與頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢他啶與頭孢他啶/克拉維酸，加克拉維酸者比不加克拉維酸者抑菌圈直徑≥5 mm 為ESBLs 陽性。質控菌株為金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853），均由中國醫(yī)學菌種保藏中心提供。經檢測，143 株KP 中78 株產ESBLs，產酶率為54.5%，均來自呼吸道標本。檢出產ESBLs KP 株的患兒中位年齡20 天，男性45 例、女性33例。

參照CLSI推薦的藥敏試驗方法[2]，采用微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗。78株產ESBLs KP對24種抗生素呈現不同程度的耐藥，氨芐西林、頭孢唑啉和哌拉西林的耐藥率較高，達100%；氨曲南、頭孢曲松和四環(huán)素耐藥率均達74%以上；阿米卡星、多尼培南、厄他培南、美羅培南、替加環(huán)素和呋喃妥因敏感率均為100%，檢出1株亞胺培南耐藥株。

將ESBLs KP 接種在MH 瓊脂平板，36 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，挑取3、4 個菌落，接種環(huán)接種到5 mL LB 培養(yǎng)基，37 ℃震蕩過夜，OMEGA Bacterial DNA Kit試劑盒提取DNA。采用PCR進行耐藥基因檢測。引物序列及循環(huán)參數按照文獻[3-5]。25 μL PCR反應體系中2×T Premix Taq液12.5 μL，上下游引物各10 pmol，模板1 μL，ddH2O補充。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，循環(huán)結束后72 ℃延伸10 min。引物長度及各引物退火溫度見表1。PCR擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，根據預期條帶判斷結果，對78 株ESBLs KP，擴增12種耐藥基因。結果顯示，檢出DHA1、Shv、Tem、CTX-M1、CTX-M3和Intl1等耐藥基因，其中shv檢出率最高，達87.2%；攜帶2種、3種和4種以上的耐藥基因的菌株分別占24株（30.7%）、49株（62.8%）和19株（24.4%），表明產ESBLs肺炎克雷伯菌耐基因的多樣及復雜性。見表2。

表1 產ESBLs肺炎克雷伯菌相關基因引物序列及產物長度

表2 產ESBLs肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測分布

2 討論

KP是腸桿菌科克雷伯菌屬中最為重要的一類菌，也是臨床上最常見的革蘭陰性桿菌之一，存在于人體上呼吸道和腸道，當機體免疫力低下，可引起社區(qū)獲得性感染及院內感染，同時其也是兒科重癥監(jiān)護病房主要致病菌之一。前期研究發(fā)現，寧波地區(qū)KP位于兒童重癥監(jiān)護病房感染病原菌第一位[6]。本研究顯示，分離出KP的標本來源以呼吸道標本為主，占81.8%，提示KP 導致的醫(yī)院感染仍以呼吸道感染多見，與相關文獻報道一致[7-8]。

KP對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機制是產ESBLs，后者由質粒介導，能水解青霉素類、頭孢菌素及單環(huán)類抗生素。本研究顯示，143株KP產ESBLs率為54.5%，不同于國內其他文獻報道[9-10]。不同地區(qū)KP產ESBLs攜帶率不同，甚至同一地區(qū)不同醫(yī)院的攜帶率也有較大差別，這種差異形成的原因可能與菌株所在地區(qū)的流行有關，而攜帶率在醫(yī)院感染菌株中的差異與醫(yī)院抗感染藥物的應用差異有關。

本研究顯示，78 株產ESBLs KP 氨芐西林和哌拉西林耐藥率較高，達100%，與其他報道一致[11]，并且對氨曲南、頭孢曲松和四環(huán)素耐藥率均達74%以上。此外，本研究檢測出1株亞胺培南耐藥株，應引起高度重視，規(guī)范使用碳青霉烯類抗菌藥物。

本研究對產ESBLs KP擴增12種耐藥基因，結果顯示DHA 1、Shv、Tem、CTX-M 1、CTX-M 3和Intl 1有不同程度檢出，其中Shv最多見，與國內其他報道一致[12]，并且攜帶2 種、3 種和4 種以上的耐藥基因的菌株分別占30.7%、62.8%和24.4%，表明本地區(qū)產ESBLs KP耐基因的多樣及復雜性。

綜上，KP 是引起醫(yī)院感染尤其是重癥監(jiān)護病房內感染的重要病原菌，特別是產ESBLs多重耐藥株更易在住院患兒間播散，有可能導致醫(yī)院感染的暴發(fā)流行[13]。兒童重癥監(jiān)護病房醫(yī)師更應合理使用抗菌藥物，參考本地耐藥特征及藥敏結果使用抗菌藥物。