漯河垃圾填埋場除臭菌種篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

趙黨陽

(漯河市環(huán)境衛(wèi)生服務(wù)中心，河南 漯河 462000)

隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，生活垃圾量增長迅速，衛(wèi)生填埋仍然是現(xiàn)階段垃圾的主要處理方式，填埋過程中會產(chǎn)生大量的惡臭氣體，主要組分包括含氮化合物、硫化物、烴類及芳香烴、鹵代烴以及酮醇醛酚等含氧有機物，嚴(yán)重影響人體健康[1]。經(jīng)過近年來的研究，生物除臭法越來越受到重視，與物理、化學(xué)等除臭方法相比，具有處理效率高、工藝流程簡單、適用范圍廣及處理費用低等優(yōu)點。除臭微生物種類繁多，如何篩選出適應(yīng)本地環(huán)境的高效菌株成為生物除臭法效果的關(guān)鍵。

本研究從漯河市垃圾衛(wèi)生填埋場的生活垃圾和垃圾滲濾液中分離篩選有效除臭菌株，通過實驗優(yōu)化菌種培養(yǎng)條件，并對除臭效果進行檢驗研究，目的在于減輕垃圾填埋場產(chǎn)生的惡臭氣體對環(huán)境的污染。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗材料來源

試驗用材料取自漯河市垃圾衛(wèi)生填埋場新進場垃圾和新鮮產(chǎn)生的垃圾滲濾液。

1.1.2分離菌種所用培養(yǎng)基[2]

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨(5 g)、牛肉膏粉(5 g)、瓊脂(19 g)、氯化鈉(5 g)、蒸餾水(1 000 mL)，pH值(7.0～7.2)，121 ℃滅菌30 min。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨(10 g)、牛肉膏粉(3 g)、氯化鈉(5 g)、蒸餾水(1 000 mL)，pH值(7.0～7.2)，121 ℃滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1菌種分離純化

將生活垃圾粉碎后與垃圾滲濾液用無菌水稀釋，手動振蕩10 min，充分搖勻，采用十倍稀釋法制成10-9～10-3的菌懸液，采取平板表面涂布法將不同濃度的溶液分別涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，每個濃度重復(fù)3次，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)基上的菌落采用平板稀釋分離法進一步純化，獲取純培養(yǎng)，然后將特征不同的菌落在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，保存?zhèn)溆肹3]。

1.2.2菌種篩選

將分離出的菌株分別接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于200 r/min搖床上，在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)5天，將培養(yǎng)物按10%接種量分別接種到裝有100 g破碎后的生活垃圾、垃圾滲濾液的1 L錐形瓶中，用玻璃棒攪勻后密封，30 ℃靜止培養(yǎng)7天，期間均勻間隔24 h，用惡臭氣體濃度測定儀測定惡臭氣體濃度，選取指標(biāo)為氨氣和硫化氫，以此來判定菌株的除臭效果。

1.2.3組合菌除臭劑的制備

將互不拮抗的菌株進行兩兩組合、三三組合、全部組合，共有11個處理組，然后選出抑制氨氮和硫化氫效果最好的菌種組合[4]。經(jīng)斜面活化后接種到裝有營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，置于200 r/min搖床上，在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)5天，即獲得組合菌除臭劑。

1.3 組合菌劑除臭條件優(yōu)化

分別在溫度為20、25、30、35、40 ℃，培養(yǎng)時間分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90 h培養(yǎng)基pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和接種量5%、10%、15%、20%、25%條件下，測定組合菌除臭劑對氨氣和硫化氫的去除率，每個試驗重復(fù)3次[5]。

1.4 菌株的鑒定

經(jīng)過菌株篩選試驗，對具有明顯抑制氨氣和硫化氫的菌株進行觀察和生理生化性能測定，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》鑒定除臭微生物的種屬[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離純化

通過劃線法分離菌株，根據(jù)菌株的顏色、邊緣透明度、形狀和鏡下觀察結(jié)果，樣本中的微生物分類結(jié)果見表1。

表1 樣本中微生物分類

由表1得知，新鮮進場垃圾和新鮮垃圾滲濾液中共分離出細(xì)菌、真菌和放線菌37株，其中細(xì)菌數(shù)量最多，其次是真菌，放線菌數(shù)量最少，所占比例分別為59.5%、24.3%、16.2%。另外，從表1可以看出，新鮮生活垃圾中微生物數(shù)量比新鮮垃圾滲濾液中微生物數(shù)量多，所占比例分別為62.2%、37.8%。

2.2 菌株的篩選

將分離得到的37株菌種分別接種到培養(yǎng)基中，在30 ℃恒溫、200 r/min搖床條件下培養(yǎng)5天，然后按10%接種量分別接種到裝有100 g新鮮粉碎生活垃圾的1 000 mL錐形瓶中，并用玻璃棒將培養(yǎng)液和垃圾攪拌均勻，密封錐形瓶，30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)7天。期間每隔24 h分別測定氨氣和硫化氫濃度，與對照比較，除臭效果明顯的有6株，分別命名為L1、L2、L3、L4、L5、L6。

測定結(jié)果如表2所示。

表2 不同菌株在不同時間內(nèi)去除NH3和H2S的效率

續(xù)表2 不同菌株在不同時間內(nèi)去除NH3和H2S的效率

從表2可以看出，去除NH3和H2S效果明顯的菌株有6種，其中有4種為細(xì)菌，1種為真菌，1種為放線菌。對NH3去除率最高的是L1，去除率達到40.7%，對H2S去除率最高的是L1和L3，去除率均為54.5%。這表明，細(xì)菌的除臭效果較好。從時間上來看，對于NH3和H2S的去除率較高的時間段集中在2～4天，從5天起效果不再增加，尤其是H2S去除方面基本保持不變，這可能是因為培養(yǎng)基營養(yǎng)消耗殆盡，菌落生長逐漸停滯的緣故[7]。

2.3 組合菌種除臭劑的制備

2.3.1菌株之間的拮抗性試驗

將篩選出的6種菌株在瓊脂培養(yǎng)基上“兩兩”十字劃線，若菌株之間有拮抗作用，則交叉處無菌落生長，用“+”表示，反之用“-”表示，結(jié)果見表3。

表3 除臭菌株之間的拮抗性

從表3可以看出，L1、L2、L3三種細(xì)菌菌株之間無拮抗性，L1和L6、L4和L5、L4和L6之間分別存在拮抗性。由于L1對NH3和H2S的去除率較高，而L4與L1、L2、L3菌株之間均無拮抗作用，因此選擇L1、L2、L3、L4這四種菌株制備組合菌除臭劑。

2.3.2最佳組合菌種除臭劑的制備

將四種菌株分別按照“兩兩”“三三”和全部組合，測定其對NH3和H2S的去除率，見圖1、圖2。

圖1 不同組合菌種對NH3去除效果的影響

圖2 不同組合菌種對NH3去除效果的影響

從圖1和圖2可以看出，不同菌種之間的組合，對于NH3和H2S的去除率，有的比單株高，有的比單株低，雖然通過拮抗性試驗，各菌種之間互不拮抗，但可能存在某種互相抑制作用影響NH3和H2S的去除率。從圖1和圖2還可以看出，L1+L2+L3+L4組對NH3去除率達47.3%，對H2S的去除率達57.7%，去除效果最佳，所以用4種菌株全組合制備除臭劑。

2.4 組合菌株除臭劑優(yōu)化條件確定

2.4.1不同溫度對除臭劑效果的影響

將除臭劑接種在新鮮垃圾錐形瓶中，分別在20、25、30、35、40 ℃條件下，測定對NH3和H2S的去除率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同溫度對除臭劑效果的影響

由圖3可以看出，隨著溫度的增加，菌株對NH3和H2S兩種氣體的去除率均呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢。當(dāng)溫度為30 ℃時，菌株對兩種氣體的去除率最佳。其原因可能是溫度對微生物酶活性的影響，從而對除臭效果有所影響。

2.4.2不同發(fā)酵時間對除臭劑效果的影響

在最佳除臭溫度30 ℃條件下，將除臭劑接種在盛有新鮮垃圾的錐形瓶中，分別測定10、20、30、40、50、60、70、80、90 h不同發(fā)酵時間對除臭效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同時間對除臭劑效果的影響

由圖4可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，菌株對NH3和H2S兩種氣體的去除率均呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間為60 h時，菌株對兩種氣體的去除率最佳。發(fā)酵時間過短，微生物生長數(shù)量不足，除臭相關(guān)的酶分解較少；發(fā)酵時間過長，營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，菌株逐漸死亡，再加上代謝廢物濃度增多，對菌株的生長抑制作用逐漸增強，同樣會影響除臭效果[8]。

2.4.3不同pH值對除臭劑效果的影響

按照最佳除臭溫度30 ℃和發(fā)酵時間60 h，調(diào)節(jié)新鮮垃圾pH值，測定pH值對除臭效果的影響。結(jié)果見圖5。

圖5 初始pH值對除臭劑效果的影響

由圖5可以看出，初始pH值在5～8.5時，隨著pH值升高，菌株對NH3和H2S兩種氣體的去除率均呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢。當(dāng)初始pH值為6.5時，菌株對兩種氣體的去除率最佳。pH值對微生物代謝活動影響較大，不同pH值會直接影響除臭菌株的酶分解效果[9]。

2.4.4不同接種量對NH3和H2S的抑制影響

按照最佳除臭溫度30 ℃、發(fā)酵時間60 h和pH值6.5的條件下，將除臭劑最優(yōu)組合菌株按照不同的接種量接種于新鮮垃圾中，結(jié)果見圖6。隨著接種量的提高，菌株對NH3和H2S兩種氣體的去除率均呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢。當(dāng)接種量為15%時，菌株對兩種氣體的去除率最佳。接種量對微生物對數(shù)生長期影響較大，可以縮短發(fā)酵階段菌體生長的延滯期，從而縮短發(fā)酵周期，但并不是接種量越大越有利，當(dāng)接種量從15%遞增到25%時，除臭效果下降，這可能是因為接種量過高導(dǎo)致菌種提前進入衰亡期[10]。

圖6 不同pH值對除臭劑效果的影響

2.5 菌株的初步鑒定

將4種菌株分別接種在瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基平板上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌落特征，隨后進行生理生化性能測定，結(jié)果見表4。

表4 四種菌株的個體形態(tài)及生理生化特征

3 結(jié)論

自然界中，臭氣產(chǎn)生源必然存在抑制臭氣的微生物，通過分離篩選出這類微生物，優(yōu)化培養(yǎng)形成優(yōu)勢混合菌群，通過多種微生物之間互營共生作用、菌株間的加性效應(yīng)，能夠更好地對惡臭產(chǎn)生抑制作用。從漯河市垃圾衛(wèi)生填埋場新鮮生活垃圾和新產(chǎn)生的滲濾液中分離出的37種菌株中有6株對NH3和H2S抑制效果明顯，通過拮抗試驗，確定了4種菌株用來制備組合菌株除臭劑。對復(fù)合微生物除臭條件優(yōu)化結(jié)果表明：最佳除臭溫度為30 ℃、發(fā)酵時間為60 h、pH值為6.5、接種量為15%。在最佳除臭條件下，NH3的去除率為58.7%，H2S的去除率為72.2%。通過菌株的初步鑒定，L1、L4為乳酸片球菌，L2為巨大芽胞桿菌，L3為糞產(chǎn)堿桿菌[11]。