流動注射分光光度法測定魚肉及其制品中揮發(fā)酚殘留量

程銀棋鄭 欣柳 迪馮 灝朱 影彭青枝周陶鴻

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430075；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術研究中心，湖北 武漢 430075；3. 武漢市華測檢測技術有限公司，湖北 武漢 430223)

酚類化合物是一種芳香族羥基化合物。根據(jù)沸點差異，通常分為揮發(fā)酚(<230 ℃)和不揮發(fā)酚(≥230 ℃)。揮發(fā)酚是水產(chǎn)品常規(guī)監(jiān)測項目，參考中國水產(chǎn)研究院[1]建議魚中揮發(fā)酚殘留量標準≤0.2 mg/kg。據(jù)文獻[2]記載有生活在中下層水中的魚(如：青魚、鯉魚等)揮發(fā)酚殘留量很高。水產(chǎn)品中過量的酚能影響水產(chǎn)品血液中的各項酶活性，酚能通過改變鏈接蛋白位置來對人體腸道上皮細胞的功能產(chǎn)生阻礙作用[3]，酚還能抑制腸道乳酸菌的活性[4]。此外，還有酚類化合物對人及哺乳動物有促癌作用的報道[5]。目前，中國已有測定魚肉中揮發(fā)酚含量的標準方法(GB 5009.231—2016《食品安全國家標準 水產(chǎn)品中揮發(fā)酚殘留量測定》)，但無論是在蒸餾還是萃取、比色過程中都存在諸多影響揮發(fā)酚檢測準確性的因素。

連續(xù)流動分析儀是近年來迅速發(fā)展起來自動化程度高，環(huán)境污染小、人為誤差低的自動生化分析儀[6]。其原理是樣品或標準溶液通過一個采樣器被蠕動泵吸出流過整個系統(tǒng)，同時反應所需要的試劑也通過泵自動加入，與樣品或標準溶液混合反應，并在最后流經(jīng)檢測器時完成對目標物的檢測和信號記錄以及分析過程。根據(jù)檢測方式的不同分為流動注射分光光度法、流動注射原子光譜法、流動注射電化學分析法、流動注射熒光及化學發(fā)光法等[7-10]。該方法消耗的試劑量以及樣品的取樣量(以微升為計量單位)較揮發(fā)酚含量標準檢測方法(GB 5009.231—2016)用量少，節(jié)約成本，廢液少，環(huán)境污染小[11-12]。

研究擬采用連續(xù)流動分析儀建立魚肉及其制品中揮發(fā)酚殘留量快速檢測的流動注射分光光度法，并與GB 5009.231—2016《食品安全國家標準 水產(chǎn)品中揮發(fā)酚殘留量測定》法進行方法學上比較，以期為檢測機構及生產(chǎn)企業(yè)提供檢測技術指導及應用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料

鮮魚及魚制品：湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院日常監(jiān)督抽檢及風險監(jiān)測的抽檢樣品。

1.1.2 儀器

電子分析天平：ME204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

全自動連續(xù)流動分析儀：San++型，荷蘭SKalar公司；

超聲波雙頻清洗機：SB25-12DTS型，寧波新芝生物科技有限公司；

均質(zhì)器：B-400型，瑞士Buchi實驗室儀器公司；

超純水器：PURELAB Chorus l型，英國ELGA公司。

1.1.3 試劑

氯化銨、氨水、NaOH、鐵氰化鉀、硫酸、硫酸銅：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

4-氨基安替比林：德國Sigma公司；

苯酚標準儲備溶液：濃度為1 000 mg/L，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

(1) 標準中間液：吸取1 mL 1 000 mg/L苯酚標準溶液于100 mL容量瓶中，用0.01 moL/L NaOH溶液定容至刻度，混勻，即為10.00 mg/L苯酚標準中間液。

(2) 標準使用液：吸取10 mL 10.00 mg/L苯酚標準中間液于100 mL容量瓶中，0.01 moL/L NaOH溶液定容至刻度，混勻，待用，即為1.00 μg/mL酚標準使用液。

(3) 標準系列工作液：分別吸取1.00 μg/mL酚標準使用液0.00，0.20，0.50，1.00，1.50，2.00，4.00 mL 置于100 mL 容量瓶中，用0.01 moL/L NaOH溶液定容至刻度，混勻，待用，即為0.00～40.00 μg/L標準系列液濃度，臨用配制。

1.2.2 樣品前處理 鮮魚去鱗、內(nèi)臟、骨及刺，清洗后粉碎機粉碎，均質(zhì)器勻漿后裝于密封袋，于-20 ℃封口保存，待測。魚肉制品直接粉碎均勻，待測。前處理方法參照文獻[13]稍作改變：稱取粉碎后的樣品4 g (精確至0.001 g)于100 mL容量瓶中，加入75 mL 100 g/L NaOH溶液，超聲10 min，滴入3滴甲基橙指示劑，然后加入9.2 mol/L硫酸至溶液呈橙紅色，加入100 g/L 硫酸銅溶液5 mL，加蒸餾水定容至刻度，混勻，過濾，收集濾液，過0.45 μm微孔水系濾膜，待上機。

1.2.3 樣品測定方法 接通電源，依次打開軟件工作站、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器、自動進樣器等設備，迅速將取樣器沖洗管及3條試劑管放入純水中，清洗5 min，后將取樣器沖洗管放入0.01 mol/L NaOH溶液中，3條試劑管分別放入對應試劑瓶(試劑瓶A：0.4 mg/mL 4-氨基安替比林；試劑瓶B：1 mg/mL 鐵氰化鉀；試劑瓶C：10%磷酸溶液)中，運行10 min，將裝滿標準系列工作液及樣品待測液的進樣小杯置于樣品盤正確位置，后標準系列工作液與樣品待測液通過采樣器被蠕動泵吸出流出整個系統(tǒng)，并吸入空氣將流體不斷地輸送，樣品待測液與標準系列工作液與試劑C混合后在線水蒸氣蒸餾(加熱器溫度135 ℃)，后餾出液流出，依次與試劑A、試劑B混合，混合液在混合圈中充分混合并反應，再經(jīng)檢測器檢測，在500 nm濾光片下測定。

全自動連續(xù)流動分析儀控制參數(shù)：波長500 nm，進樣針清洗時間60 s，到達閥時間63 s，加熱器溫度145 ℃，注射時間97 s，進樣時間60 s，沖洗時間100 s。

1.2.4 樣品揮發(fā)酚殘留量計算 以濃度為橫坐標，響應值峰高為縱坐標，繪制標準曲線。用與繪制標準曲線相同的儀器條件，測定空白與樣品待測液的強度，按照線性方程求出相應質(zhì)量濃度，再按式(1)計算樣品中揮發(fā)酚殘留量。樣品均稱取4.000 g，提取后定容至100 mL容量瓶中。

(1)

式中：

A0——空白溶液峰高響應值，cm；

A——樣品待測液測得的峰高響應值，cm；

v——樣品定容體積，mL；

a——標準曲線截距；

k——標準曲線斜率；

m——魚肉樣品質(zhì)量，g；

X——樣品中揮發(fā)酚殘留量(以苯酚計)的含量，mg/kg。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS 12.0軟件。

2 結果與討論

2.1 方法線性及檢出限

試驗方法在0.00～40.00 μg/L范圍內(nèi)線性方程為Y=1.002X-0.152，相關系數(shù)R2=0.999 9，標準曲線峰形圖如圖1所示。表明連續(xù)流動化學分析儀測定揮發(fā)酚(以苯酚計)質(zhì)量濃度在0.00～40.00 μg/L范圍內(nèi)線性良好，可以滿足魚肉及其制品中揮發(fā)酚殘留量的檢測需求。

按照1.2試驗步驟進行11次空白試驗，經(jīng)計算得批內(nèi)標準偏差Sd為0.398，以3Sd所對應樣品中揮發(fā)酚(以苯酚計)含量為檢出限。計算得出揮發(fā)酚(以苯酚計)檢出限為0.030 mg/kg，低于GB 5009.231—2016《食品安全國家標準 水產(chǎn)品中揮發(fā)酚殘留量測定》標準規(guī)定的檢出限0.05 mg/kg要求，說明流動注射分光光度法檢出限低、方法可靠。

圖1 標準曲線峰形圖

2.2 精密度及回收率

分別取代表性海水魚(帶魚、大黃魚)、淡水魚(草魚、鯽魚)、魚肉制品(魚丸、魚糕)4 g，按照1.2步驟進行樣品前處理及測定，6次重復試驗測得精密度結果見表1。由表1可知：連續(xù)流動分析儀測定6種魚肉及其制品中的揮發(fā)酚殘留量精密度為0.952%～6.543%，低于GB 5009.231—2016《食品安全國家標準 水產(chǎn)品中揮發(fā)酚殘留量測定》規(guī)定的≤10%的精密度要求。

分別取代表性海水魚(帶魚、大黃魚)、淡水魚(草魚、鯽魚)、魚肉制品(魚丸、魚糕)4 g，按照1.2步驟的樣品前處理及方法測定要求，進行低、中、高3水平(0.05，0.10，0.50 mg/kg)加標回收率試驗。由表2可知，連續(xù)流動分析儀測定6種魚肉及其制品中的揮發(fā)酚殘留(以苯酚計)加標回收率為72.000%～90.827%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中規(guī)定的檢測方法確認的回收率技術指標的要求，說明該方法測定魚肉及其制品中的揮發(fā)酚殘留(以苯酚計)加標回收率較好。

表1 精密度測定

表2 回收率測定

2.3 方法驗證

2.3.1 檢測結果比對 采用GB 5009.231—2016《食品安全國家標準 水產(chǎn)品中揮發(fā)酚殘留量測定》與試驗方法對含一定含量的揮發(fā)酚(以苯酚計)樣品測定，檢測結果如表3所示，試驗方法測定6種樣品的峰形圖如圖2所示。由表3可知，試驗方法與標準方法重現(xiàn)性較好，儀器比對差異為2.0%～8.4%。另外，淡水魚揮發(fā)酚殘留量比海水魚低，可能是海水被石油等污染導致?lián)]發(fā)酚殘留量較高，海水魚較淡水魚生活在更下層，污染較為嚴重，揮發(fā)酚殘留量濃度較高，與文獻[14-16]報道一致。

2.3.2 測試效率比對 從檢測樣品數(shù)、試劑用量、廢液產(chǎn)生量及測試時間四方面進行比較，結果如表4所示。由表4可知，試驗方法比標準方法試劑用量節(jié)省93%以上、樣品測定用時節(jié)省65%、測試效率提升3倍。由于試驗方法所用樣品待測液不足1.5 mL，大大減少了分析過程中與顯色劑等試劑污染，廢液產(chǎn)生量減少56.5%。此外，試驗方法考慮了水蒸汽蒸餾過程的揮發(fā)酚殘留量損失情況，標準系列工作液于同樣儀器條件下，經(jīng)過蒸餾提取，得到的線性方程使得樣品待測液中揮發(fā)酚殘留量濃度更準確，這一點較標準方法更精確。

圖2 樣品峰形圖

表3 連續(xù)流動分析法與標準方法比對

表4 測試效率比較

3 結論

試驗選擇有代表性的淡水魚、海水魚及其魚肉制品為研究對象，通過在線水蒸汽蒸餾提取，探究了流動注射分光光度法測定揮發(fā)酚殘留量(以苯酚計)，在儀器優(yōu)化條件下，揮發(fā)酚殘留量(以苯酚計)濃度在0.00～40.00 μg/L 的范圍內(nèi)遵循比爾定律，有良好的線性關系，相關系數(shù)為0.999 9，方法檢出限、精密度均低于GB 5009.231—2016《食品安全國家標準 水產(chǎn)品中揮發(fā)酚殘留量測定》規(guī)定的檢出限0.05 mg/kg、精密度≤10%的要求；加標回收率符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中規(guī)定的檢測方法確認的指標要求；流動注射分光光度法比標準方法試劑用量節(jié)省93%以上，樣品測定用時節(jié)省65%，廢液產(chǎn)生量減少56.5%，測試效率提升3倍。試驗證明，建立的方法具有檢出限低、高效、環(huán)保及大批量樣品檢驗的優(yōu)勢，適用于檢測機構及生產(chǎn)企業(yè)推廣應用。