河蜆抗氧化肽—鋅螯合物的制備及結構表征

劉晶晶 徐蘊桃 朱晨慧 黃倩倩 韓曜平 王雪鋒 張 然 戴陽軍

(常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500)

河蜆(Corbiculafluminea)，一種常見的軟體動物，別名黃蜆、沙蜊等，原產(chǎn)于亞洲，主要棲居于淡水(或咸淡水)河、湖和入?？谔帯：油槧I養(yǎng)價值高，干樣粗蛋白高達60%左右，粗脂肪約為10.91%[1]，其中糖蛋白、金屬硫蛋白等具有預防腫瘤、氧化和調節(jié)免疫等功能；含有17種氨基酸，其中必需氨基酸占總氨基酸的39%；此外，還富含EPA、DHA及大量活性多糖物質，能有效對抗心血管疾病、增強機體免疫[2]，為保健類產(chǎn)品的優(yōu)質原材料，其藥用和食療價值引起了越來越多國內外學者的關注。

鋅作為一種人體必不可少的微量元素，與動物的感官功能和記憶有關，全球約25%的人存在缺鋅問題[3-4]。研究[5]表明，多肽—鋅螯合物可經(jīng)肽消化吸收通路將鋅元素輸往血液，更利于機體利用，可彌補傳統(tǒng)鋅制劑利用率低和生物毒性高的不足，與氨基酸鋅相比，其吸收更快，能耗更少。

近年來，有關抗氧化肽金屬螯合物方面的研究多集中于螯合工藝條件優(yōu)化及抗氧化性測定，關于螯合產(chǎn)物結構的研究相對較少，相關的研究[6-7]缺少對螯合原料多肽的純化，無法確保螯合原料的純度，對螯合產(chǎn)物的結構分析也不夠全面。試驗擬以河蜆為原料，制備抗氧化肽—鋅螯合物，采用多種光譜分析河蜆抗氧化肽螯合鋅的結構性質，為抗氧化肽金屬螯合物的構效關系及實際應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

速凍河蜆肉：江蘇省宿遷楠景水產(chǎn)品有限公司；

中性蛋白酶：分析純，上海藍季生物有限公司；

葡聚糖凝膠G-50：上海藍季科技發(fā)展有限公司；

雙硫腙、三氯乙酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

七水合硫酸鋅、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、水合茚三酮：分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司；

三氯化鐵、硫化鈉、鐵氰化鉀：分析純，天津致遠化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

分析天平：EL104型，梅特勒—托利多儀器制造有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-2型，金壇市杰瑞爾電器有限公司；

高速組織搗碎機：上海市比朗儀器制造有限公司；

超低溫冰箱：BCD-216TDXZA型，青島市海爾電器股份有限公司；

臺式冷凍干燥機：Alpha 1-2 LDplus型，博勱行儀器有限公司；

高速臺式冷凍離心機：TGL-16M型，長沙市湘儀有限責任公司；

數(shù)字pH計：pHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

集熱式恒溫磁力攪拌器：DF-101B型，金壇市醫(yī)療儀器廠；

自動部分收集器：BSZ-30型，上海滬西分析儀器廠；

紫外分光光度計：UV-754型，上海市精密科學儀器制造有限責任公司；

紫外—可見分光光度計：Cary300型，美國安捷倫公司；

傅立葉紅外光譜儀：Nicolet iS10型，美國賽默飛世爾科技公司；

熒光分光光度計：F-7000型，日本日立公司；

X射線衍射儀：D/max-2200/pc型，日本理學公司；

熱場發(fā)射電鏡掃描儀：ZEISS ΣIGMA型，德國卡爾蔡司。

1.2 試驗方法

1.2.1 河蜆抗氧化肽的制備

(1) 河蜆肉酶解液粉末的制備：將速凍河蜆肉解凍清洗，擠干稱重，加入2倍質量的蒸餾水，搗碎攪勻。按河蜆肉質量的3.76%添加中性蛋白酶，55.36 ℃酶解4 h[8]，100 ℃水浴滅酶20 min，冷卻后，4 000 r/min離心30 min，取上層清液，冷凍干燥，粉碎，冷藏待用。

(2) 河蜆抗氧化肽的分離純化：根據(jù)文獻[9]的方法稍作修改。取適量河蜆肉酶解液粉末，配成濃度為50 mg/mL樣液，4 000 r/min離心30 min，采用葡聚糖凝膠G-50對上清液進行分離。上樣量2 mL，蒸餾水作洗脫液，由自動收集器每5 min收集一管，樣品流速0.5 mL/min，共集400管，測定收集液的吸光度值。根據(jù)吸光度值合并相同分離峰的洗脫液，干燥成粉末，冷藏待測。

(3) 各組分總抗氧化性的測定：稱取分離后各個分離峰的酶解液粉末，分別配成50 mg/mL的溶液。量取1 mL各樣液于試管中，分別加入0.2 mol/L(pH=6.6)PBS溶液和1%的K3[Fe(CN)6]溶液各1 mL，于50 ℃水浴20 min，添加質量分數(shù)10%的三氯乙酸溶液1 mL，1 000 r/min 離心4 min。取上清液1 mL，分別加入蒸餾水1 mL和0.1%的三氯化鐵溶液0.2 mL，振動搖勻，50 ℃ 水浴10 min，溶液漸漸由黃變藍[10-11]，于700 nm處測定其吸光值。蒸餾水代替樣品作空白組。

1.2.2 河蜆抗氧化肽—鋅螯合物的制備 稱取一定量的抗氧化肽凍干粉末，配成20 mg/mL的溶液，充分攪勻，按肽鋅質量比2.18∶1加入一定量的硫酸鋅溶液，調節(jié)pH至5.07，52.65 ℃下反應46.50 min[12]，冷卻，4 000 r/min 離心20 min，取沉淀，用80%乙醇進行洗滌再離心，反復數(shù)次，上清液中分別加入雙硫腙和水合茚三酮(檢測溶液中的游離鋅離子和抗氧化肽)直至不變色。沉淀冷凍干燥備用。

1.2.3 河蜆抗氧化肽-鋅螯合物的定性檢測 根據(jù)文獻[13]略作修改。稱取少量反應產(chǎn)物凍干粉，蒸餾水溶解，滴入5滴茚三酮指示劑，加熱煮沸3 min，觀察是否發(fā)生顏色變化。取適量反應產(chǎn)物凍干粉配成溶液，添加過量的硫化鈉粉末，放置5 min，若有沉淀生成，5 000 r/min離心5 min，取上清液，滴5滴水合茚三酮指示劑，沸騰3 min，觀察是否出現(xiàn)顏色變化。

1.2.4 河蜆抗氧化肽—鋅螯合物的結構表征 根據(jù)文獻[6，14]的方法并稍作修改。

(1) 紫外—可見光光譜分析：將制備好的抗氧化肽—鋅螯合物配制成0.1 mg/mL溶液，8 000 r/min離心15 min，取上清液放入掃描室，設置波長190～400 nm進行掃描分析。并在相同條件下對參加反應的抗氧化肽進行處理，作為對照組。

(2) 紅外光譜分析：稱取螯合物粉末2 mg，加入適量的色譜級KBr，研磨，烘干。取少量研磨后的粉末進行壓片并置于樣品槽中，4 000～500 cm-1內掃描。并在相同條件下對參與螯合反應的抗氧化肽進行處理，作為對照組。

(3) 熒光光譜分析：分別稱取適量的抗氧化肽與抗氧化肽—鋅螯合物，配制成1 mg/mL的溶液，8 000 r/min離心20 min，取上清液用于檢測。蒸餾水作對照，設激發(fā)波長280 nm，室溫條件下測定兩種樣品在320～520 nm處的發(fā)射光譜。

(4) X射線衍射分析：取適量抗氧化肽—鋅螯合物研磨至直徑<10 μm，填入樣品槽中，鋪壓成平整試片，設置儀器參數(shù)為加速電壓40 kV，掃描范圍(2θ)5°～90°，掃描速度4°/min。并在相同條件下對參與螯合反應的抗氧化肽粉末進行預處理并掃描。

(5) 掃描電鏡分析：用牙簽挑取少量抗氧化肽和抗氧化肽—鋅螯合物粉末，均勻涂至貼有黑色雙面膠的載樣板上，再于噴金裝置內噴金。將預處理好的樣品進行掃描，掃描電鏡工作電壓5 kV，3 000×獲得圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel記錄和匯總試驗數(shù)據(jù)，采用Excel和Origin 7.0軟件進行制圖分析。

2 結果與分析

2.1 河蜆抗氧化肽的分離純化

2.1.1 葡聚糖凝膠G-50分離河蜆肉酶解液 由圖1可知，河蜆肉酶解液經(jīng)分離后共得到5個清晰的洗脫峰，按洗脫液出峰的順序分別將其命名為F1、F2、F3、F4、F5。

2.1.2 河蜆肉酶解液中抗氧化肽的總抗氧化性 由圖2可知，5個組分均具有抗氧化活性，組分F2、F3的總抗氧化性能高于其他3個組分的，700 nm處的吸光值分別為2.03，1.79。鮑魚下腳料抗氧化肽最高抗氧化活性A700 nm為(0.598±0.050)[15]，蟹抗氧化肽最高抗氧化活性A700 nm為0.841[16]，說明河蜆肉酶解液抗氧化肽具有較高的研究價值。

圖1 河蜆肉酶解液的Sephadex G-50 洗脫曲線

2.2 抗氧化肽—鋅螯合物的定性分析

研究[17]表明，金屬硫化物在一般情況下的穩(wěn)定常數(shù)大于抗氧化肽金屬螯合物的，當加入硫化鈉時，常溫下就可將抗氧化肽—鋅螯合物中的鋅離子置換，生成更穩(wěn)定的硫化鋅沉淀，原反應物中的抗氧化肽變成游離態(tài)。通過試驗可知，抗氧化肽與鋅的反應產(chǎn)物經(jīng)水合茚三酮指示劑在煮沸情況下檢測后未變色，無多余的游離抗氧化肽原料，說明螯合產(chǎn)物有一定的純度。當添加過量的硫化鈉粉末后，產(chǎn)生了沉淀，離心后上清液中滴加茚三酮試劑發(fā)生變色，表明上清液存在游離抗氧化肽，說明抗氧化肽與鋅發(fā)生了螯合反應。綜上，抗氧化肽與鋅發(fā)生螯合且螯合反應得到了有一定純度的螯合物粉末。

2.3 抗氧化肽—鋅螯合物的結構表征

2.3.1 紫外光譜分析 由圖3可知，抗氧化肽溶液最大吸光度對應的波長為194.02 nm，屬于抗氧化肽羰基和肽鍵的特征吸收峰。加入鋅螯合后，抗氧化肽—鋅螯合物吸收峰發(fā)生了變化，最大吸收峰接近190 nm，與螯合前的差距>4 nm，可能是鋅離子與抗氧化肽螯合后改變了原有的基團結構，基團原子的價電子發(fā)生躍遷，最大吸光度對應的波長產(chǎn)生移動[18]，說明抗氧化肽與鋅發(fā)生了螯合。

圖3 抗氧化肽—鋅螯合物與抗氧化肽的紫外光譜

圖4 抗氧化肽—鋅螯合物與抗氧化肽的紅外光譜

2.3.3 熒光光譜分析 由圖5可知，河蜆抗氧化肽與鋅螯合前后的熒光強度存在顯著差異(P<0.05)，螯合后的抗氧化肽分子中的熒光生色基團發(fā)生了結構上的變化，抗氧化肽中加入鋅離子后圖譜由1個強峰變?yōu)?個弱峰，說明鋅離子與抗氧化肽發(fā)生了螯合反應，改變了原有結構。

2.3.4 X射線衍射光譜分析 由圖6可知，抗氧化肽與抗氧化肽螯合鋅的衍射強度峰存在顯著差異(P<0.05)表明抗氧化肽在螯合鋅離子后，自身結構發(fā)生了一定改變。

圖5 抗氧化肽—鋅螯合物與抗氧化肽的熒光光譜

圖6 抗氧化肽—鋅螯合物與抗氧化肽的X射線衍射光譜

2.3.5 電鏡掃描結構分析 由圖7可知，抗氧化肽表面更光滑且存在空洞，可能是抗氧化肽經(jīng)冷凍干燥后留下的親水區(qū)痕跡；抗氧化肽—鋅螯合物表面更粗糙，存在許多顆粒結構物質(鋅晶體)[20]，這些顆粒經(jīng)電鏡掃描電擊后仍牢牢覆蓋于肽表面，使原本光滑的肽面凹凸不平，說明鋅與肽發(fā)生了相互作用且結合緊密，結構也變得更加復雜。

圖7 掃描電鏡圖

3 結論

由于制備的抗氧化肽—鋅螯合物結構較為復雜，其具體結構及一些生物活性機理有待進一步探究，鋅離子與各基團連接鍵的類型也有待進一步研究。