白藜蘆醇改善妊娠期糖尿病大鼠及子代糖耐量和胰島功能

邵錦華， 邵 娟， 汪 寧， 孫 瑾

（1.西安市第五醫(yī)院陜西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院老年病科，西安 710000； 2.西安市第五醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710082； 3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科，西安 710000； 4.西安市第五醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，西安 710000）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）指妊娠晚期首次發(fā)病的高血糖癥[1]。其特征主要是胰島素抵抗、高胰島素血癥、糖耐量減低、高血糖、妊娠體質(zhì)量異常增加以及分娩期間并發(fā)癥風(fēng)險增加[2]。既往診斷妊娠期糖尿病能增加孕婦患高血壓、肥胖和心血管疾病的風(fēng)險[3]。此外，妊娠期糖尿病子代更容易發(fā)生肥胖、糖尿病和心血管疾病[4]。因此，減緩和控制妊娠期糖尿病的發(fā)展至關(guān)重要。

治療上，首選生活方式的改變（如運動和飲食控制），其次是藥物治療（如胰島素、格列本脲和二甲雙胍）[5]。然而，藥物療法常常伴隨不良結(jié)果，如孕產(chǎn)婦低血糖和巨大胎兒等。因此，尋找新療法預(yù)防GDM尤為重要。白藜蘆醇（RESV）具有強大的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[6]。有研究[7-8]表明，RESV可改善產(chǎn)婦子宮動脈血流，減少妊娠期體質(zhì)量和增加胰島素敏感性，其作用途徑與運動和卡路里限制相似。因此，其作為輔助治療具有潛在的實用價值。但RESV是否可以用于GDM的治療及母親補充RESV對子代的糖耐量和胰島功能是否有影響尚不清楚。因此，本文對飲食誘導(dǎo)的GDM大鼠模型補充RESV，以探究對子代的糖耐量和胰島功能的改善作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RESV和膠原酶V購自美國Sigma公司。RPMI-1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清購自美國康寧公司。大鼠胰島素ELISA試劑盒和大鼠胰高血糖素放射免疫試劑盒購自美國密理博公司。低脂飼料和高脂飼料購自美國Research Diet公司。卓越快速血糖儀購自美國羅氏公司，NanoDropTM 2000分光光度計購自美國Thermo公司，共聚焦顯微鏡購自美國Leica公司。

1.2 實驗動物分組及模型制備

3周齡健康雌性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，采用飲食誘導(dǎo)肥胖的大鼠模型進行研究。對照組（n=6）大鼠給予低脂飲食（10%kcal脂肪），GDM 大鼠（n=12）給予高糖高脂飲食（45%kcal脂肪）持續(xù)8周以誘導(dǎo)肥胖，隨后雌鼠與喂食對照飼料的雄鼠交配。檢測妊娠中末期血糖濃度，血糖＞7.8 mmol·L-1代表造模成功。GDM大鼠隨機分為GDM組及GDM+RESV干預(yù)組，每組6只，從妊娠第14天開始，給予添加 RESV 的高脂飲食［4 g·（kg·d）-1］，并持續(xù)整個哺乳期。為避免食物爭奪，每窩幼鼠數(shù)量被控制在8只。3周哺乳期結(jié)束后，隨機分配雄性和雌性子鼠，給予12周的低脂或高脂飲食，每周記錄進食量和體質(zhì)量。15周齡時，檢測子鼠的糖耐量水平和胰島素功能。

1.3 葡萄糖耐受實驗

在母鼠孕晚期（妊娠18.5 d）和子鼠15周時分別進行葡萄糖糖耐量試驗，測試前，所有大鼠禁食12 h。每只大鼠腹腔注射2 g·kg-1濃度為20%的葡萄糖溶液，分別在 0、30、60、90、120 min 時，尾靜脈檢測并記錄血糖。

1.4 分離大鼠胰島

子代喂養(yǎng)至20周時，腹腔注射10%水合氯醛1.5～2 mL麻醉大鼠后，采用經(jīng)膽總管插管注入膠原酶V的方法對母代大鼠胰腺進行消化后鈍性分離摘取胰腺，將胰腺置于膠原酶V中37℃水浴消化15 min，每2～3 min手動振搖。消化后，加入RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%L-谷氨酰胺純化胰島，2000×g，4℃水平離心 20 min。棄去上清液，用PBS液重懸。解剖顯微鏡下分離胰島，隨后置于RPMI-1640培養(yǎng)基中37℃、5%CO2孵育過夜。

1.5 胰島激素檢測

體外培養(yǎng)的胰島給予16.7 mmol·L-1葡萄糖刺激30 min。按照說明書操作，用大鼠胰島素ELISA試劑盒測定胰島素濃度，用放射免疫試劑盒檢測胰高血糖素的分泌。通過酸-醇體外提取胰島中總胰島素和胰高血糖素，水中重懸后分別用上述試劑盒測定，數(shù)據(jù)用DNA總量進行歸一化，采用NanoDropTM 2000分光光度計定量分析。每組實驗獨立重復(fù)3次。計算各組胰島素抵抗指數(shù)穩(wěn)態(tài)模型（HOMA-IR），計算公式：HOMA-IR=空腹血糖水平（FPG）×空腹胰島素水平（FINS）/22.5。

1.6 免疫熒光染色

取大鼠胰島組織，固定，按照冰凍切片常規(guī)步驟進行制片，然后采用大鼠免疫熒光染色試劑盒觀察體外培養(yǎng)的胰島中胰島素的表達，在玻片上滴加熒光抗體染液，加蓋37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，蒸餾水沖洗后封片，共聚焦顯微鏡拍攝圖像。每組實驗至少重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Prism 7.0（美國GraphPad公司）統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組母鼠進食量和體質(zhì)量變化

對照組、GDM組和GDM+RESV組母鼠整個孕期攝入能量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。與對照組比較，而GDM組、GDM+RESV組母鼠的進食量降低，體質(zhì)量增加（P均＜0.05），與GDM組比較，GDM+RESV組母鼠體質(zhì)量下降（P＜0.05）。見表1。

表1 各組母鼠進食量和體質(zhì)量變化（±s）

表1 各組母鼠進食量和體質(zhì)量變化（±s）

與對照組比較*P＜0.05；與GDM組比較#P＜0.05。

組別 進食量/g 攝入能量/kcal 體質(zhì)量/g對照組 48.2±1.2 179.8±32.1 306.8±9.5 GDM 組 40.2±1.7* 182.4±33.2 486.2±12.5*GDM+RESV 組 38.8±1.5* 175.2±34.0 438.8±10.0*#F值 70.359 0.073 448.962 P值 ＜0.001 0.930 ＜0.001

2.2 各組子鼠進食量和體質(zhì)量變化

三組低脂和高脂飲食子鼠進食量及攝入能量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；三組低脂飲食子鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而三組高脂飲食子鼠體質(zhì)量均較低脂飲食子鼠增加（P均＜0.05），且與對照組高脂飲食子鼠相比，GDM組和GDM+RESV組高脂飲食子鼠體質(zhì)量增加，GDM+RESV組高脂飲食子鼠較GDM組高脂飲食子鼠體質(zhì)量降低（P均＜0.05）。見表2。

2.3 RESV對妊娠晚期母鼠糖耐量的影響

GDM組妊娠晚期母鼠的血糖濃度與糖耐量水平高于對照組（P＜0.05），而GDM+RESV組母鼠的血糖濃度與糖耐量水平低于GDM組（P＜0.05）。見圖1。

2.4 RESV對妊娠晚期母鼠胰島功能的作用

與對照組母鼠相比，GDM組、GDM+RESV組母鼠血漿胰島素濃度降低，且HOMA-IR下降（P均＜0.05）。與對照組母鼠相比，GDM+RESV組母鼠血漿胰島素濃度和HOMA-IR指數(shù)升高（P均＜0.05）。與對照組相比，GDM組母鼠離體胰島素分泌量以及離體總胰島素含量降低，而GDM+RESV組母鼠離體胰島素含量增加，離體總胰島素含量降低（P均＜0.05）；GDM+RESV組離體胰島素分泌量和離體總胰島素含量均較GDM組升高（P均＜0.05）。見表3。

表2 各組子鼠進食量和體質(zhì)量變化（±s）

表2 各組子鼠進食量和體質(zhì)量變化（±s）

與對照組高脂飲食子鼠比較*P＜0.05；與GDM組高脂飲食子鼠比較#P＜0.05；與GDM組低脂飲食子鼠比較&P＜0.05；與GDM+RESV組低脂飲食子鼠比較$P＜0.05。

母鼠 子鼠進食量/g 攝入能量/k c a l 體質(zhì)量/g對照組 低脂飲食 4 6.6±2.8 1 9 1.5±1 0.1 3 5 0.2±1 2.0*高脂飲食 4 2.6±3.9 2 0 0.1±1 9.0 3 8 0.6±2 1.1#$G D M組 低脂飲食 4 8.1±3.0 1 9 3.6±9.1 3 6 5.5±1 2.8高脂飲食 4 6.1±5.9 2 0 5.6±3 8.2 4 5 8.2±3 0.8*&G D M+R E S V組 低脂飲食 4 6.7±2.6 1 9 1.3±1 2.8 3 5 5.9±1 8.4高脂飲食 4 4.5±2.7 2 0 3.2±1 5.2 3 9 8.0±1 6.8*#$F值 — 1.7 9 1 0.4 9 5 3 1.9 9 1 P值 — 0.1 6 2 0.7 9 3 ＜0.0 0 1

2.5 母鼠補充RESV對高脂飲食子鼠糖耐量的作用

GDM組子鼠的血糖濃度與糖耐量水平高于對照組子鼠（P＜0.05），而GDM+RESV組子鼠的血糖濃度與糖耐量水平低于GDM組子鼠（P＜0.05）。見圖2。

2.6 母鼠補充RESV對高脂飲食子鼠胰島功能的作用

GDM組子鼠的血漿胰島素濃度、離體胰高血糖素分泌量以及離體總胰高血糖素含量均降低，離體胰島素分泌量高于對照組子鼠（P均＜0.05），GDM+RESV組血漿胰島素濃度、離體胰高血糖素分泌量、離體胰島素分泌量高于對照組子鼠（P均＜0.05）；GDM+RESV組血漿胰島素濃度、離體胰高血糖素分泌量、離體總胰島素含量高于GDM組，離體胰島素分泌量低于GDM組（P均＜0.05）。見表4。免疫熒光檢測顯示，與對照組相比，GDM組胰島素水平減弱，而GDM+RESV組子鼠的胰島素水平升高。見圖3。

表3 RESV對妊娠晚期母鼠胰島功能的作用

表4 母鼠補充RESV對高脂飲食子鼠胰島功能的作用（±s）

表4 母鼠補充RESV對高脂飲食子鼠胰島功能的作用（±s）

與對照組比較*P＜0.05；與GDM組比較#P＜0.05。

組別 血漿胰島素濃度/（n g·m L-1）離體總胰高血糖素含量/（n g·μ g-1）對照組 5.8 8±0.7 0 0.7 5±0.1 1 0.7 2±0.1 4 3 2.8 7±2.2 2 7.4 1±0.5 0 G D M 組 5.0 1±0.6 3* 3.2 8±0.2 0* 0.3 7±0.0 8* 3 2.0 8±1.9 9 4.2 2±0.3 8*G D M+R E S V 組 7.8 4±0.8 5*# 2.1 8±0.1 5*# 1.0 7±0.2 5*# 3 5.5 9±2.7 0# 4.3 5±0.2 7 F值 2 5.5 0 1 3 8 8.3 0 3 2 4.9 1 5 3.7 7 2 1 2 5.5 5 1 P 值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 0.0 4 7 ＜0.0 0 1離體胰島素分泌量/（n g·μ g-1）離體胰高血糖素分泌量/（n g·μ g-1）離體總胰島素含量/（n g·μ g-1）

3 討論

肥胖和2型糖尿病在孕婦中發(fā)病率極高，據(jù)報道，育齡婦女超重和肥胖率逐年增加[9]。此趨勢導(dǎo)致GDM發(fā)病率不斷上升，不僅嚴(yán)重威脅了孕產(chǎn)婦的身心健康，同時還增加了其子代成年后發(fā)生肥胖、2型糖尿病以及其他心腦血管疾病的風(fēng)險[10]。因此，找到安全有效控制孕婦GDM的方法迫在眉睫。本研究中探討RESV作為GDM治療策略的作用，以及其對子代成年后糖耐量和胰島功能的長期影響，以期為治療和預(yù)防GDM提供新靶點和新思路。

盡管生活方式的干預(yù)仍是目前治療GDM的首選方案，但由于患者依從性較差且缺乏孕期運動強度和頻率的標(biāo)準(zhǔn)，其效果往往十分有限。因此，可發(fā)揮與運動或者能量限制類似作用的天然產(chǎn)物如RESV，在治療GDM以及控制其并發(fā)癥方面有著巨大前景[11]。以往關(guān)于RESV對GDM的研究，多集中于采用鏈脲霉素誘導(dǎo)的1型糖尿病動物模型，且多針對僅在孕早期或者整個孕期和哺乳期補充RESV[12-13]。本研究在孕晚期發(fā)現(xiàn)GDM時，給予RESV治療可改善GDM大鼠葡萄糖耐受不良、降低血糖水平、提高胰島素分泌和胰島功能；此外，給母鼠補充RESV可預(yù)防其子鼠肥胖，同時改善子鼠葡萄糖刺激的胰島素分泌，從而可能延緩其代謝性疾病的發(fā)生。本研究與前期利用RESV進行預(yù)防研究形成對比，首次觀察RESV在孕晚期作為治療藥物對GDM母鼠及其子代糖耐量和胰島功能的作用。盡管RESV口服生物利用度較低，但是當(dāng)其作用于母體時，可透過胎盤屏障作用于胎兒[14]，因此，有必要關(guān)注RESV對胚胎發(fā)育的影響。有研究[15]報道，孕期大鼠補充RESV對胎兒體質(zhì)量和發(fā)育無明顯作用；鏈脲霉素誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠其子代出生體質(zhì)量下降，孕期補充RESV可使其子鼠體質(zhì)量恢復(fù)正常。若GDM大鼠血糖未得到有效控制，巨大兒的風(fēng)險提高。本研究中顯示，給予高脂飲食，RESV治療的GDM母鼠，其子鼠體質(zhì)量高于對照組，提示具有降糖作用的RESV，可作為GDM的候選治療藥物。有研究[16]報道，患GDM的女性，其子代在成年后胰島β細胞功能受損。本研究表明，與對照組母鼠的子鼠相比，GDM母鼠的子鼠血漿胰島素濃度、離體胰高血糖素分泌量以及離體總胰高血糖素含量均降低，離體胰島素分泌量增加，說明GDM母鼠的子鼠給予高脂飲食后，其胰島分泌胰島素和胰高血糖素受損，因此GDM母鼠的子鼠血漿及離體胰島素和胰高血糖素分泌量均異常，而通過RESV干預(yù)母鼠，可改善其子鼠高脂飲食狀態(tài)下的胰島功能。

綜上所述，孕晚期補充RESV可改善GDM母鼠及其子鼠的糖耐量水平和胰島功能，提示其可作為GDM的候選藥物進行進一步研究。然而，本研究尚存在一定的局限性。例如，本研究未能檢測母鼠和子鼠的RESV血藥濃度。此外，孕期激素水平的變化是否與RESV發(fā)揮的改善糖耐量和胰島功能的作用有關(guān)，尚待進一步研究證實。