聚苯乙烯納米探針與丁二酮肟反應(yīng)耦合共振瑞利散射-能量轉(zhuǎn)移光譜法測(cè)定痕量尿素

姚東梅，盧珊珊，溫桂清，梁愛(ài)惠，蔣治良*

1. 珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西師范大學(xué))，廣西 桂林 541004 2. 河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 546300

引 言

隨著現(xiàn)代科技的不斷進(jìn)步，微納米尺度的材料的發(fā)展越來(lái)越受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注，人們也愈益認(rèn)識(shí)到新型功能材料的重要性。聚苯乙烯納米微球(PS)是一種易得的高分子材料，可通過(guò)乳液聚合、分散聚合、懸浮聚合、種子溶脹等方法來(lái)制備[1-3]。PS具有球形度好、比表面積大、骨架密度低、吸附性強(qiáng)、力學(xué)強(qiáng)度高、與不同極性的有機(jī)溶劑兼容性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，在熒光分析[4-5]，電化學(xué)檢測(cè)[6-7]，細(xì)胞成像[8]等領(lǐng)域已有應(yīng)用。Cui等[4]通過(guò)在PS磁珠上將大量量子點(diǎn)(QD)進(jìn)行疊層組裝，開(kāi)發(fā)了一種基于QD的新擴(kuò)增熒光標(biāo)簽，用于雙DNA目標(biāo)檢測(cè)。該方法靈敏度高，但是需要進(jìn)行標(biāo)記，操作較復(fù)雜。Wang等[7]基于多層CdS量子點(diǎn)功能化PS作為生物探針和氧化石墨烯-聚苯胺復(fù)合材料的信號(hào)放大策略，開(kāi)發(fā)了一種新型的超靈敏電化學(xué)生物傳感器，用于10～1.0×107/mL-1K562細(xì)胞的檢測(cè)。該方法具有很高的特異性和靈敏度。Qu等[8]制備了聚乙二醇(PEG)接枝的聚苯乙烯微球，基于Fe3+在細(xì)胞質(zhì)中的選擇性熒光猝滅作用，可用于細(xì)胞內(nèi)Fe3+的成像。該方法中PS具有良好的生物相容性和可忽略的細(xì)胞毒性，但是實(shí)驗(yàn)成本較高。據(jù)我們所知，尚未發(fā)現(xiàn)PS探針用于共振瑞利散射(RRS)光譜分析，因此，研究PS在RRS分析中的應(yīng)用具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-7000熒光光譜儀(Hitachi Co. Ltd)；TU-1901紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；FEI Quanta 200場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡(Thermo Fisher, USA)；HH-S2電熱恒溫水浴鍋(金壇市大地自動(dòng)化儀器廠)；SK3300超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

聚苯乙烯納米微粒(Polystyrene nanoparticles，PS)采用乳液聚合制備, 其粒徑為 (50.0～100 nm，Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd)。0.25 mg·mL-1聚苯乙烯納米微粒溶液制備：因該微球不能直接溶入水，但可采用以下方法制備其水溶液。準(zhǔn)確稱(chēng)取12.5 mg聚苯乙烯納米微粒于20 mL甲苯中，溶解完全后加入50 mL水，超聲至甲苯全部揮發(fā)完，溶液呈深乳白色，即得到0.25 mg·mL-1聚苯乙烯納米微粒溶液。1 mg·mL-1尿素(UR)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g UR溶于二次水中，定容到100 mL容量瓶中得到16.65 mmol·L-1UR標(biāo)準(zhǔn)液，使用時(shí)逐級(jí)稀釋?zhuān)? mol·L-1HCl溶液：取5 mL 12 mol·L-1HCl于干凈的10 mL量筒中加入5 mL二次蒸餾水；3%丁二酮肟(DMG)：0.18 g DMG溶解于6 mL 6 mol·L-1的HCl中得到3% DMG溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用；2.2×10-2mol·L-1胺基硫脲(TSC)：0.200 4 g TSC溶于100 mL二次水中得到2.2×10-2mol·L-1TSC溶液備用。所用試劑均為分析純級(jí)，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 方法

準(zhǔn)確吸取一定量40 μg·mL-1UR溶液于試管中，加入250 μL 6 mol·L-1HCl溶液，20 μL 2.2×10-2mol·L-1TSC，150 μL 3% DMG，搖勻，置80 ℃水浴中加熱20 min，冷卻后，加入140 μL 0.25 mg·mL-1聚苯乙烯納米微粒，用二次蒸餾水定容至2 mL，靜置8 min。用日立F-7000熒光光譜儀(電壓350 V，狹縫5 nm)獲得溶液在200～700 nm的共振瑞利散射光譜，記錄500 nm處的RRS強(qiáng)度(I)，以不加UR作空白記錄空白強(qiáng)度(I0)，并計(jì)算ΔI=I0-I。

2 結(jié)果與討論

在酸性條件下，丁二酮肟在水溶液中首先反應(yīng)生成中間產(chǎn)物雙乙酰，雙乙酰進(jìn)一步與尿素在穩(wěn)定劑TSC的作用下共熱生成穩(wěn)定的紅色二嗪衍生物DIK，作為RRS供體的PS與受體DIK之間發(fā)生共振瑞利散射能量轉(zhuǎn)移，隨著UR濃度的增加，生成的紅色產(chǎn)物DIK越多，共振瑞利散射能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象越明顯，體系在500 nm處的RRS信號(hào)強(qiáng)度線性降低，并且在一定范圍內(nèi)，RRS信號(hào)降低值與UR濃度成線性關(guān)系，據(jù)此可建立檢測(cè)UR的RRS-ET分析方法。

2.1 RRS和吸收光譜

在強(qiáng)酸及80 ℃水浴中，研究了PS體系的RRS光譜。該體系在400及500 nm處分別有一個(gè)RRS峰，500 nm處RRS信號(hào)隨著UR濃度增大逐漸降低(圖1)，主要是由于隨著UR的濃度增大，生成的DIK越來(lái)越多，RRS-ET現(xiàn)象越來(lái)越明顯的原因。紫外吸收光譜表明，分析體系在530 nm處有吸收峰，且隨著UR濃度的增大，體系的吸光度逐漸增大，是因?yàn)樯傻腄IK越來(lái)越多。

圖1 UR-DMG-PS體系的RRS光譜

2.2 聚苯乙烯微球的表征

PS在375及500 nm處分別有一個(gè)RRS峰，隨著RRS濃度的增大，其在375及500 nm處的RRS信號(hào)逐漸上升。375 nm處的RRS峰不發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，500 nm處譜峰與DIK之間發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移。PS的吸收峰出現(xiàn)在310～330 nm處左右，隨著濃度增大，吸收信號(hào)逐漸增大，波長(zhǎng)發(fā)生微小紅移，可能與其濃度有關(guān)。

按照實(shí)驗(yàn)方法制備樣品，取2 μL樣品溶液滴到硅片表面，自然晾干后用掃描電子顯微鏡記錄樣品形貌，從圖2可知，聚苯乙烯微球呈球形結(jié)構(gòu)，顆粒粒度不夠均勻，平均粒徑為63 nm。

圖2 聚苯乙烯納米微粒的掃描電鏡圖像Fig.2 Scanning electron microscope image of PS

2.3 分析優(yōu)化條件

對(duì)影響測(cè)定的試劑濃度進(jìn)行研究。結(jié)果表明，當(dāng)HCl溶液濃度為0.75 mol·L-1，TSC溶液濃度為0.22 mmol·L-1，DMG溶液濃度為19.35 mmol·L-1，聚苯乙烯納米微粒的濃度為17.5 μg·mL-1水浴溫度為80 ℃，水浴反應(yīng)時(shí)間為20 min時(shí)，體系ΔI最大。因此，選擇以上條件作為反應(yīng)最佳條件。

2.4 工作曲線

按照實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制了體系的工作曲線。對(duì)于UR-DMG-PS體系，在一定范圍內(nèi)，隨著UR濃度的增大，體系的ΔI值逐漸增大，尿素濃度在2.0～3 200 ng·mL-1范圍內(nèi)與共振瑞利散射信號(hào)降低值ΔI呈良好的線性關(guān)系(圖1)，線性方程為ΔI=0.327c+108.8，線性相關(guān)系數(shù)為0.9764，檢出限2.0 ng·mL-1。與已報(bào)道的方法比較(表1)，本方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，是一種快速檢測(cè)UR的新方法。

表1 測(cè)定尿素的分析方法的比較Table 1 Comparison of analytical methods for detecting UR

2.5 干擾離子的影響

2.6 樣品測(cè)定

取某人不同時(shí)間段A，B和C的三種尿液，分別稀釋100倍后得到樣品儲(chǔ)備液，然后取10 μL樣品儲(chǔ)備液按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定。其含量分別為179.1，282.3和466.3 μg·mL-1尿素，樣品加標(biāo)回收率在94.19%～96.94%之間，RSD在4.20%～6.35%之間。

3 結(jié) 論

利用PS在超聲條件下溶解于甲苯中得到乳白色懸浮液作為共振瑞利散射能量的供體。在強(qiáng)酸及穩(wěn)定劑氨基硫脲存在條件下，丁二酮肟與尿素共熱生成穩(wěn)定的紅色二嗪衍生物4，5-二甲基-2-咪唑酮與聚苯乙烯納米微粒結(jié)合發(fā)生RRS-ET效應(yīng)，據(jù)此建立了RRS-ET分析尿素的新方法，方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)。