IDO抑制劑LPM3480226心血管安全性藥理研究

王 宇,李春梅,傅風華,田京偉

(煙臺大學新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),山東 煙臺 264005)

IDO是肝臟外唯一催化色氨酸(Trp)吲哚環(huán)氧化裂解,沿犬尿氨酸(Kyn)途徑分解代謝的限速酶[1-2]．近年來,研究發(fā)現(xiàn)IDO與腫瘤免疫逃逸密切相關,可通過多種機制介導腫瘤免疫逃逸如色氨酸耗竭抑制局部T細胞增殖、色氨酸代謝產(chǎn)物促進T細胞的凋亡、誘導調(diào)節(jié)性T細胞增殖等[3-4]．

LPM3480226是Epacadostat的結構類似藥物,已申請化合物專利、晶型專利及制備工藝專利．化學名稱為:順-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(脲乙基)硫)-1, 2, 5-噁二唑-3-羰肟酰胺,分子式為C12H12BrFN6O3S,相對分子質(zhì)量419.23．前期申報研究資料(CXHL1800024)表明LPM3480226作為選擇性IDO抑制劑,可逆轉IDO介導的腫瘤免疫耐受,激活效應T細胞,改善腫瘤免疫微環(huán)境,協(xié)同增強其他藥物如免疫檢查點藥物和化療藥物的腫瘤殺傷抑制作用,可用于肺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌和黑色素瘤的治療,具有極好的開發(fā)前景．

安全藥理學的研究應根據(jù)受試藥物的臨床用藥目的和藥物作用特點合理地進行實驗設計,采用國內(nèi)外認可的體內(nèi)或體外方法,包括科學而有效的新技術和新方法．為了進一步考證IDO抑制劑LPM3480226的臨床安全性,本研究通過對細胞和Beagle犬多次給藥,進行hERG鉀通道道(human Ether-a-go-go Related Gene potassium channel)電流的抑制作用和Beagle犬II導聯(lián)心電圖及血壓各指標的研究,評價該化合物對心血管系統(tǒng)的影響,為進一步開發(fā)提供科學依據(jù)．

圖1 LPM3480226結構式

1 實驗材料

1.1 細胞株與實驗動物

穩(wěn)定轉染了人Kv11.1(hERG)離子通道的中國倉鼠卵巢細胞hERG-CHO(Chinese Hamster Ovary)由內(nèi)部構建,液氮凍存,于5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)．

普通級Beagle犬,6只,雌雄各半,首次給藥時年齡為9～10月齡,體重為8.20～11.15 kg,購自北京瑪斯生物技術有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0001,質(zhì)量合格證流水號:11400600002039(雌性)、11400600002038(雄性)．所有實驗用動物均在溫度為22.09～24.78 ℃,相對濕度為43.72%～67.45%,人工照明,12 h/12 h明暗交替條件下適應環(huán)境7 d,并給予自由飲食和飲水．本研究經(jīng)過煙臺大學動物倫理委員會審查批準．

1.2 藥品與試劑

LPM3480226購自上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司;陽性對照化合物cisapride(西沙比利)購自Sigma公司．

1.3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司),離心機(美國Beckman公司),Axopatch 200B膜片鉗系統(tǒng)(美國Axon公司),植入式生理信號無線遙測系統(tǒng)(美國DSI公司),全自動五分類血液分析儀(德國西門子公司),全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司),全自動血凝分析儀(日本希森美康公司)．

2 實驗方法

2.1 hERG實驗

2.1.1 化合物準備 測試當天,將20 mmol/L的化合物母液用100% DMSO進行3倍連續(xù)稀釋,即取10 μL 20 mmol/L的化合物母液加入20 μL DMSO,依次得到6個經(jīng)DMSO連續(xù)稀釋的化合物中間濃度．然后再取10 μL的化合物中間濃度加入到4 990 μL細胞外液中,500倍稀釋得到需要測試的最終濃度,最高測試濃度為40 μmol/L,依次分別為40、13.3、4.4、1.48、0.49和0.16 μmol/L共6個濃度．陽性對照化合物cisapride準備:取150 μmol/L的cisapride母液用100% DMSO進行3倍連續(xù)稀釋,即取10 μL 150 μmol/L的cisapride母液加入20 μL DMSO,依次得到5個經(jīng)DMSO連續(xù)稀釋的cisapride中間濃度．然后再取10 μL的cisapride中間濃度加入到4990 μL細胞外液中,500倍稀釋得到需要測試的最終濃度,最高測試濃度為300 nmol/L,依次分別為300、100、33.3、11.1和3.70 nmol/L共5個濃度．最終測試濃度中的DMSO含量不超過0.2%,此濃度的DMSO對hERG鉀通道沒有影響[5]．

2.1.2 電生理記錄過程 穩(wěn)定表達hERG鉀通道的CHO細胞,在室溫下用全細胞膜片鉗技術記錄hERG鉀通道電流．尖端電阻為2～5 MΩ左右的玻璃微電極連接至Axopatch 200B(Molecular Devices)膜片鉗放大器．鉗制電壓和數(shù)據(jù)記錄由pClamp 10軟件通過電腦控制和記錄,采樣頻率為10 kHz,濾波頻率為2 kHz．在得到全細胞記錄后,細胞鉗制在-80 mV,誘發(fā)hERG鉀電流(IhERG)的步階電壓從-80 mV給予一個2 s的去極化電壓到+20 mV,再復極化到-50 mV,持續(xù)1 s后回到-80 mV．每10 s給予此電壓刺激,確定hERG鉀電流穩(wěn)定后(1 min)開始給藥過程．化合物濃度從低測試濃度開始連續(xù)給藥,每個測試濃度給予1 min．每個濃度至少測試3個細胞(n≥3)．

2.1.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析處理采用pClamp 10,PatchMaster,GraphPad Prism 5和Excel軟件．不同化合物濃度對hERG鉀電流(-50 mV時誘發(fā)的hERG尾電流峰值)的抑制程度用公式(1)計算[6-7]:

Fractional block=[1-(I/I0)]×100%,

(1)

式中,Fractional block代表化合物對 hERG 鉀電流的抑制百分率,I和I0分別表示在加藥后和加藥前hERG鉀電流的幅度．

化合物的IC50使用方程(2)進行擬合計算得出[6-7]:

I/I0=1/{1+([C]/IC50)n},

(2)

式中,I0和I分別表示加藥前和加藥后hERG鉀電流的幅度．[C]為化合物的濃度,n為Hill系數(shù)．

2.1.4 溶液 細胞外液配方(mmol/L):140 NaCl,5 KCl,1 CaCl2,1.25 MgCl2,10 HEPES和10 Glucose,用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4．細胞內(nèi)液配方(mmol/L):140 KCl,1 MgCl2,1 CaCl2,10 EGTA和10 HEPES,用KOH調(diào)節(jié)pH值至7.2．

2.1.5 質(zhì)量控制 報告中的實驗數(shù)據(jù)滿足以下質(zhì)量控制指標:全細胞封接阻抗>1 GΩ;串聯(lián)電阻如大于10 MΩ補償80%以上;hERG尾電流幅度> 400 pA;衰減< 2%每分鐘;電流穩(wěn)定性:6次記錄的尾電流峰值與平均值不超過2%;藥理學指標:多濃度cisapride對hERG通道的抑制效應設為陽性對照．

2.2 Beagle犬心血管系統(tǒng)試驗

2.2.1 實驗分組 給藥途徑:經(jīng)口灌胃,與臨床擬用途徑一致.給藥頻率:分4階段給藥,每階段給藥1次,各階段給藥安排見表1.給藥體積:5 mL/kg.給藥:6只Beagle犬采用6×4改良拉丁方設計依次重復給予LPM3480226或20% Kolliphor(Solutol) HS 15,每只動物的給藥量根據(jù)最近一次測量的體重進行給藥.給藥間隔時間:每階段數(shù)據(jù)采集結束后再洗脫2～5 d.間隔時間設計依據(jù):Beagle犬經(jīng)口灌胃給予50、100 mg/kg的LPM3480226,達峰時間Tmax約為4～7.17 h,消除半衰期T1/2約為4 h．首次給藥當天作為試驗第1天,動物禁食至少12 h,不禁水．

表1 給藥安排

2.2.2 一般狀態(tài)觀察 動物飼養(yǎng)人員觀察時間與頻率:每天2次(上午和下午各1次).試驗人員觀察時間與頻率:給藥當天,給藥后觀察1次,出現(xiàn)癥狀的當天,給藥后觀察3次,其余時間,每天觀察1次.獸醫(yī):每周1～2次．具體觀察各組所有存活犬.動物飼養(yǎng)人員觀察:死亡、攝食及飲水.試驗人員及獸醫(yī)觀察:包括但不限于犬外觀體征、被毛、一般行為活動、精神狀態(tài)、腺體分泌、呼吸狀態(tài)、糞便性狀、生殖器、死亡等情況及其它毒性表現(xiàn)．

2.2.3 體重 每階段給藥前1天稱量動物體重,該體重僅用于給藥量的計算．

2.2.4 遙測數(shù)據(jù)采集 首先,進行數(shù)據(jù)采集前設置:整個遙測系統(tǒng)位于電磁屏蔽室內(nèi),隔絕外界環(huán)境的電磁干擾．采集過程,動物在籠內(nèi)自由活動．(1)植入子預先埋置在動物體內(nèi),開啟后可采集心電及動脈血壓信號．(2)RMC-1接收器接收對應植入子信號后,通過交換機最終傳輸至計算機,由Ponemah軟件對采集的信號進行實時處理并儲存在計算機硬盤內(nèi)．(3)采集參數(shù)設置:動脈血壓(BP)的采集頻率為250 Hz;心電(ECG)的采集頻率為500 Hz,數(shù)據(jù)讀取率(logging rate)設置為60 s．(4)給藥前后具體檢測指標包括血壓相關指標如收縮壓、舒張壓、平均動脈壓和II導聯(lián)心電圖相關指標如心率、RR間期、PR間期、QRS波時間、QT間期、校正QT間期．

接下來進行首次給藥前的數(shù)據(jù)采集:(1)用于試驗的遙測動物在環(huán)境適應期時,需對其體內(nèi)的植入子進行檢查,以確定植入子對生理信號的采集正常及計算機顯示的采集圖形正常．(2)在首次給藥前,需連續(xù)采集約22 h的心電及血壓數(shù)據(jù)．(3)首次給藥前采集的數(shù)據(jù)將保留在歸檔電子資料中,但該數(shù)據(jù)不用于分析或包含在最終報告中．

最后進行給藥階段的數(shù)據(jù)采集,每階段給藥前,需連續(xù)采集至少60 min的心電和血壓數(shù)據(jù),給藥后需連續(xù)采集至少24 h．

2.2.5 遙測數(shù)據(jù)分析 對于心電圖的定性分析:(1)給藥后約1 h、2 h、4 h、6 h的時間點,截取時間點前后5 min范圍內(nèi)時長約2 min的心電圖片段;給藥后約7 h、8 h、24 h的時間點,截取時間點前后10 min范圍內(nèi)時長約2 min的心電圖片段．(2)評估截取的心電圖片段中是否存在心律失常,波形是否異常,判斷心電圖標記是否正確．時間設計依據(jù):Beagle犬經(jīng)口灌胃給予50、100 mg/kg的LPM3480226,Tmax約為4 h～7.17 h,T1/2約為4 h．

對于心電圖及血壓的定量分析:分別對給藥前及給藥后至24 h的心電和血壓數(shù)據(jù)進行分析,軟件根據(jù)心電圖標記自動計算相應的指標．選取給藥前約1 h時長的數(shù)據(jù)求平均,作為給藥前的基礎值(Baseline);給藥結束后至給藥后8 h的時長對每1 h的數(shù)據(jù)求平均;給藥后8～24 h的時長對每4 h的數(shù)據(jù)求平均．以上平均值用于統(tǒng)計分析．分析時參照以下原則:(1)典型的心電圖和血壓波形由軟件根據(jù)內(nèi)置算法自動識別;(2)未自動識別的心電圖由分析人員調(diào)用該動物的心電圖模板庫進行匹配;(3)因動物異?；顒踊蛐盘杺鬏敭惓５葘Σㄐ卧斐筛蓴_導致無法判讀時,標記該數(shù)據(jù)為壞數(shù)據(jù)(Bad Data Mark)并保存在最終電子數(shù)據(jù)中[8-9]．

2.3 統(tǒng)計學方法

定性分析結果僅進行描述．

定量分析結果需進行統(tǒng)計分析,方法如下:

定量指標:定量指標先采用LEVENE檢驗進行方差齊性檢驗,當方差齊時(P>0.05),則采用單因素方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計學檢驗;當方差不齊時(P≤0.05),則采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(K-W法)進行統(tǒng)計分析．當單因素方差分析顯示差異有統(tǒng)計學意義時(P≤0.05),則采用Dunnett’st檢驗(Dunnett法)對組間差異進行比較;當單因素方差分析顯示差異無統(tǒng)計學意義時(P>0.05),則統(tǒng)計分析結束;當 Kruskal-Wallis H秩和檢驗顯示差異無統(tǒng)計學意義時(P>0.05),則統(tǒng)計分析結束．

組間差異在LPM3480226各組與對照組進行．所有檢驗均為雙側檢驗α=0.05．所有的統(tǒng)計分析,均使用SPSS 13.0 for Windows軟件完成．

3 實驗結果與討論

3.1 hERG試驗

在穩(wěn)定表達hERG鉀通道的CHO細胞上,化合物LPM3480226在40 μmol/L濃度給藥1 min后對hERG鉀電流的抑制百分率小于50%,在此條件下,該化合物抑制 hERG鉀電流的IC50值大于40 μmol/L,對hERG鉀通道無明顯的抑制作用．

化合物LPM3480226和陽性對照化合物cisapride對hERG鉀通道電流抑制作用的量效曲線和IC50如圖2所示．

3.2 Beagle犬心血管系統(tǒng)試驗

3.2.1 一般狀態(tài) 300 mg/kg組大部分犬(5/6)給藥后見嘔吐黃色液體/食物或白色泡沫,1只犬(1/6)給藥后可見不成形糞便;30 mg/kg組和100 mg/kg組僅在第1階段給藥后各有2只犬(2/6)、1只犬(1/6)嘔吐黃色液體/食物．除此以外,各組犬其余時間一般狀況良好,自主活動正常,亦未見其他異常反應．

圖2 LPM3480226和cisapride對hERG鉀通道電流抑制作用的量效曲線圖和IC50

3.2.2 對血壓的影響 LPM3480226各組犬給藥后24 h內(nèi)的血壓各指標的均值與同期對照組相比(圖3—5),差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)．

給藥后各時間段各指標與自身給藥前的差值與同期對照組差值相比,30 mg/kg組犬藥后0～1 h,收縮壓(圖3)、平均動脈壓(圖5)降低,藥后0～1 h、16～20 h,舒張壓(見圖4)降低;100 mg/kg組犬藥后0～1 h,收縮壓、舒張壓、平均動脈壓降低;300 mg/kg組犬藥后0～1 h,收縮壓、平均動脈壓降低,藥后0～1 h、12～16 h、16～20 h、20～24 h,舒張壓降低;上述差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)．

LPM3480226各組犬給藥后部分時間段血壓與自身給藥前的差值與對照組的差值相比可見小幅度降低,且其均值與同期對照組相比未見明顯改變,無明顯劑量相關性,無毒理學意義．

除此以外,該組犬在上述時間段其他血壓指標與自身給藥前的差值與同期對照組差值相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);在其余時間段,血壓各指標與自身給藥前的差值與同期對照組差值相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)．

3.2.3 對II導聯(lián)心電圖的影響 定性分析結果:藥后1 h、2 h、4 h、6 h、7 h、8 h、24 h時間點,各組犬II導聯(lián)心電圖波形、心率等均未見異常改變．

給藥后各時間點,各組犬主要具有診斷意義的心電圖異常見表2.除表2中動物以外,給藥后各時間段,各組犬未見其他明顯異常心電圖改變．

竇性心動過緩(心率低于60 bpm)或過速(心率高于180 bpm)是正常Beagle犬常見的自發(fā)改變,且本試驗中散在發(fā)生于個別時間點,非藥物因素所致,無毒理學意義．

圖3 經(jīng)口灌胃給予LPM3480226對Beagle犬收縮壓的影響

圖4 經(jīng)口灌胃給予LPM3480226對Beagle犬舒張壓的影響

圖5 經(jīng)口灌胃給予LPM3480226對Beagle犬平均動脈壓的影響

表2 具有診斷意義的心電圖異常

定量分析結果:LPM3480226各組犬給藥后24 h內(nèi)各時間段心率(圖6)、RR間期(圖7)、PR間期(圖8)、QRS波時間(圖9)、QT間期(圖10)、校正QT間期(圖11)II導聯(lián)心電圖定量分析指標平均數(shù)與同期對照組相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)．

給藥后各時間段各指標與自身給藥前的差值與同期對照組差值相比,30 mg/kg組犬藥后0～1 h、1～2 h、8～12 h、12～16 h,QT間期延長;100 mg/kg組犬藥后0～1 h、12～16 h,QT間期延長;300 mg/kg組犬藥后0～1 h、2～3 h,RR間期延長,藥后0～1 h,心率減慢,藥后0～1 h、1～2 h、7～8 h、8～12 h、12～16 h,QT間期延長;上述差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)．

LPM3480226各組犬給藥后部分時間段,QT間期可見延長,但相應時間段的校正QT間期未見明顯變化,且與同期對照組相比其均值也未見明顯變化,無毒理學意義．

300 mg/kg組犬藥后0～1 h可見心率小幅度減慢,約16%(均值的幅度),并引起相關聯(lián)指標RR間期延長,但與同期對照組相比其均值未見明顯變化,且無劑量相關性,無毒理學意義．

除此以外,LPM3480226其余組給藥后其余時間段II導聯(lián)心電圖各指標與自身給藥前的差值與同期對照組差值相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)．

圖6 經(jīng)口灌胃給予LPM3480226對Beagle犬心率的影響

圖7 經(jīng)口灌胃給予LPM3480226對Beagle犬RR間期的影響

圖8 經(jīng)口灌胃給予LPM3480226對Beagle犬PR間期的影響

圖9 經(jīng)口灌胃給予LPM3480226對Beagle犬QRS波時間的影響

圖10 經(jīng)口灌胃給予LPM3480226對Beagle犬QT間期的影響

圖11 經(jīng)口灌胃給予LPM3480226對Beagle犬校正QT間期的影響

4 討 論

在心肌細胞中,hERG基因編碼快速激活的延遲整流鉀通道(IKr),IKr在心臟復極過程中起到重要作用,阻滯IKr是藥物導致QT間期延長,誘發(fā)尖端扭轉性室速(Torsade de Pointes,TdP)最重要的機制．藥源性心臟毒性是導致藥物撤市及新藥研發(fā)失敗的主要原因,而QT間期延長又是新藥安全性評價的關鍵指標之一,目前,檢測化合物對hERG鉀通道的作用是臨床前評價藥物心臟安全性的關鍵步驟．最常用的檢測方法是通過膜片鉗技術測定藥物對異源轉染hERG鉀通道的哺乳動物細胞(HEK293細胞系、CHO 細胞系)上IKr的抑制率[9],得出阻斷50% hERG電流所需的藥物濃度(即IC50)．但是,hERG鉀通道檢測是體外試驗,不能完全反映人類電生理特性,且不同實驗室實驗條件不同、缺乏相同標準,仍具有一定的局限性．實驗中選擇cisapride作為陽性對照化合物,之前的文獻中有報導稱cisapride對hERG鉀電流抑制的IC50值范圍在5 nmol/L～66 nmol/L[10],本次試驗同一天內(nèi)檢測cisapride得到的IC50值為26.6 nmol/L,說明試驗系統(tǒng)穩(wěn)定可靠,測試結果準確．結果表明,各劑量LPM3480226對hERG鉀通道無明顯的抑制作用．

對于心血管系統(tǒng)的研究,主要測定給藥前后血壓(包括收縮壓、舒張壓和平均動脈壓等)、心電圖(包括QT間期、PR間期、QRS波等)和心率等的變化．觀察血壓等指標需要選擇體型較大的動物,一般可以用大鼠、犬等,實驗操作方法分為麻醉動物測定法和清醒動物測定法．麻醉劑和束縛可能會使Beagle犬的血壓上升,現(xiàn)多采用清醒動物進行心血管系統(tǒng)指標的測定(如遙測技術等)[11]．無線遙測技術近幾年在新藥安全性評價中得到廣泛關注,是國際安全藥理學指導原則(ICH S7A)推薦的心血管系統(tǒng)首選的方法[12],更為客觀和重要,具有明顯的優(yōu)越性．觀察給藥前及給藥后至24 h內(nèi)的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓和II導聯(lián)心電圖各指標(心率、R-R間期、P-R間期、QRS波時間、Q-T間期、校正Q-T間期)．結果表明各劑量LPM3480226對Beagle犬II導聯(lián)心電圖及血壓各指標未見影響．

綜上所述,本研究通過科學合理的實驗設計,綜合考慮到藥物對鉀通道及心血管系統(tǒng)指標的影響,保證了實驗的完整性、數(shù)據(jù)的準確性,為藥物安全性評價提供了更為全面的實驗研究基礎．

5 結 論

LPM3480226對hERG鉀通道無明顯的抑制作用且對II導聯(lián)心電圖及血壓各指標無明顯影響,具有良好的心臟安全性．