替莫唑胺酯納米粒的制備及抗腦膠質(zhì)瘤活性研究

韓俊萍,王良霄,沙春潔,王愛萍,楚留香,孫考祥

(1. 煙臺大學(xué)藥學(xué)院,煙臺大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學(xué)),山東 煙臺264005;2. 山東綠葉制藥有限公司長效和靶向制劑國家重點實驗室,山東 煙臺264003)

腦膠質(zhì)瘤(glioblastoma, GBM)是一種常見的并有強(qiáng)侵襲性的腦腫瘤,具有復(fù)發(fā)率高、死亡率高等特點[1-2]．替莫唑胺(temozolomide, TMZ)是一種DNA烷化劑類抗腫瘤藥物,酸性條件下穩(wěn)定,在生理環(huán)境下,可不經(jīng)酶代謝自發(fā)水解產(chǎn)生甲基重氮陽離子,該離子可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[3]．TMZ是治療GBM的一線用藥[4],然而,劑量限制性外周毒副作用限制了其應(yīng)用[5]．SVEC R L等[3]研究證明TMZ-C8酰胺基團(tuán)不是藥物發(fā)揮抗腫瘤活性所必需的,已有研究在TMZ-C8位進(jìn)行酯化改造[6-9],所得衍生物脂溶性增加,透膜性提高且對多種GBM細(xì)胞的抗腫瘤活性增強(qiáng),可實現(xiàn)低濃度抗腫瘤的治療效果．替莫唑胺辛酯(temozolomide octyl ester, TOE)為TMZ-C8位酯化改造得到的衍生物,脂溶性改善,與TMZ相似,TOE在中性與堿性條件下易開環(huán)水解釋放甲基重氮陽離子發(fā)揮抗腫瘤作用．聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)納米粒作為抗腫瘤藥物的載體[10-12],具有生物相容性好,可提高藥物穩(wěn)定性,易于靶向修飾等優(yōu)點[13-15]．

基于此,本研究擬合成替莫唑胺辛酯,為制備高效治療腦膠質(zhì)瘤的制劑,將其包載于PLGA納米粒中,研究采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備替莫唑胺辛酯納米粒(temozolomide octyl ester nanoparticles, TOE-NPs),通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方,以制備出藥物包載率高、粒徑合適的納米粒,并探究其體外抗膠質(zhì)瘤活性,為后續(xù)替莫唑胺酯納米粒經(jīng)鼻遞送用于GBM的治療研究奠定基礎(chǔ)．

1 實驗部分

1.1 儀器

Avane Ⅱ 600 MHz核磁共振儀(瑞士布魯克公司);API 3000 LC-MS/MS型質(zhì)譜儀(McKinley Scientific公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司);Agilent高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);DelsaNano C Zeta電位及納米粒度分析儀(Beckman Coulter公司);ZD-88B恒溫?fù)u床(江蘇省太倉市博萊特實驗儀器廠);Biofuge Primo-R離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司);BioTek Synergy4酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)．

1.2 試藥與試劑

TMZ(湖北興銀河化工有限公司);PLGA((LA∶GA=50∶50,Mw=18 000 U),山東綠葉制藥有限公司);正辛醇(阿拉丁試劑);MTT(Sigma公司);胎牛血清(上海玉博生物科技有限公司);乙腈、甲醇為色譜純,其余所有試劑均為分析純．

1.3 細(xì)胞

大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)．

1.4 TOE的化學(xué)合成

本研究參考文獻(xiàn)[15]合成方法,將TMZ水解為替莫唑胺酸(temozolomide acid, TMA),再與正辛醇酯化生成TOE,合成路線見圖1．

圖1 替莫唑胺辛酯的合成路線

將TMZ(10.00 g,51.50 mmol)溶于濃硫酸中,冰水浴條件下,滴加亞硝酸鈉飽和水溶液(0.25 g/mL, 28.50 mL),室溫攪拌過夜,反應(yīng)混合物中加入適量碎冰,冰浴冷卻,過濾,真空干燥即得TMA．將TMA(3.90 g, 20.00 mmol)溶于二氯亞砜中加DMF(0.073 g, 1.00 mmol),體系升溫至回流狀態(tài),攪拌反應(yīng)2 h,減壓蒸除二氯亞砜．適量二氯甲烷溶解產(chǎn)物,冰水浴條件下,加入正辛醇(2.60 g, 20.00 mmol),三乙胺(1.01 g, 10.00 mmol),升至室溫攪拌反應(yīng)2 h．加入飽和碳酸氫鈉溶液,分液,無水硫酸鈉干燥有機(jī)相,減壓濃縮,柱層析純化(石油醚∶乙酸乙酯=3∶1),得TOE(15.61 g,白色固體粉末),通過1H-NMR、13C-NMR、MS對目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,顯微熔點儀測定熔程,HPLC測定藥物純度和含量．

1.5 HPLC色譜條件

色譜柱:Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),流動相:乙腈-0.1%乙酸水(40∶60,V/V),流速:1 mL/min,檢測波長:327 nm,柱溫:40 ℃,進(jìn)樣量:20 μL．該色譜條件下TMZ和TOE的保留時間分別為2.2 min和10.8 min．

1.6 納米粒的制備

采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備TMZ-NPs和TOE-NPs．制備工藝如下:稱取處方量的藥物(TMZ或TOE)和PLGA溶于二氯甲烷和丙酮的混合溶劑(二氯甲烷∶丙酮=3∶2,V/V)中,超聲溶解,形成油相;另取處方量的1%和0.3%(W/V)的聚乙烯醇溶液分別作為內(nèi)水相和外水相,在冰水浴條件下,將油相逐滴滴入內(nèi)水相中,超聲功率為300 W,超聲3 min,形成初乳;攪拌條件下將初乳逐滴分散于外水相中,揮干有機(jī)溶劑,0.45 μm微孔濾膜濾過,即得TMZ-NPs和TOE-NPs．

1.7 載藥納米粒的表征

1.7.1 粒徑分布和Zeta電位的測定 取制備的載藥納米粒溶液,適量蒸餾水均勻分散,采用DelsaNano C Zeta電位及納米粒度分析儀測定納米粒的粒徑分布、多分散指數(shù)(polydispersity index, PDI)和Zeta電位．

1.7.2 透射電子顯微鏡觀察形態(tài) 采用磷鎢酸復(fù)染法制備TMZ-NPs和TOE-NPs透射電鏡樣品,室溫下將納米粒分散液滴于銅網(wǎng)上,均勻平鋪成薄膜,2%磷鎢酸溶液復(fù)染10 min,濾紙吸盡多余液體,透射電子顯微鏡觀察納米粒形態(tài)．

1.7.3 包封率和載藥量的測定 采用超速離心法測定納米粒的包封率與載藥量．精密量取1.0 mL TMZ-NPs或TOE-NPs于超速離心管(Mw=100 kU)4 000 r/min離心30 min,收集下層濾液,乙腈稀釋,0.22 μm微孔濾膜濾過,按“1.5”項下HPLC條件測定并計算游離TMZ或TOE質(zhì)量(m游);另取1.0 mL TMZ-NPs或TOE-NPs加適量乙腈超聲破乳,渦旋萃取,12 000 r/min離心10 min,按“1.5”項下HPLC條件測定TMZ或TOE總質(zhì)量(m總)．納米粒的包封率和載藥量計算公式為

包封率=(m總-m游)/m總×100%,

(1)

(2)

1.7.4 體外釋放 采用透析法考察納米粒的體外釋藥特性．分別量取適量TOE溶液(temozolomide octyl ester solution, TOE-Sol)、TMZ-NPs、TOE-NPs裝入預(yù)先處理好的透析袋(Mw=3 500)中,平行3份,透析袋置于40 mL釋放介質(zhì)(含1%聚山梨酯80的磷酸鹽緩沖液(W/V),pH=5.5)中,37±1 ℃、100 r/min條件下振蕩釋放．分別于0.083、0.25、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120 h時間點取出 1.0 mL釋放介質(zhì),同時補(bǔ)加同溫同體積的釋放介質(zhì),樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,續(xù)濾液按“1.5”項下HPLC條件測量藥物含量,以時間為橫坐標(biāo),TMZ或TOE累積釋放率為縱坐標(biāo)繪制釋放曲線．

1.8 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化納米粒處方

采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備載藥納米粒,通過預(yù)實驗的考察結(jié)果,選擇影響納米粒包封率(Y1)、粒徑(Y2)比較顯著的3個因素:油水比(A)、PLGA質(zhì)量濃度(B)、理論載藥量(C)為自變量,根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選擇各因素的3個水平,以包封率(Y1)、粒徑(Y2)為評價指標(biāo)進(jìn)行實驗,采用Box-Behnken響應(yīng)面法對納米粒的處方進(jìn)行優(yōu)化,考察的因素和水平如表1所示．

表1 響應(yīng)面因素水平編碼

1.9 體外抗腦膠質(zhì)瘤活性

以大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞為模型細(xì)胞,采用MTT法考察TMZ、TOE、TMZ-NPs和TOE-NPs 4組不同藥物的細(xì)胞生長抑制作用．將對數(shù)生長期的C6細(xì)胞以5×103個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,分別加入4組含有梯度濃度的藥物培養(yǎng)液,藥物濃度設(shè)置為:5、40、80、160、240 μmol/L,各組藥物每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔,同時建立空白組(只加培養(yǎng)液,不含細(xì)胞,不加藥物)和對照組(只加培養(yǎng)液,不加藥物),培養(yǎng)48 h后,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去孔內(nèi)液體后,每孔加入150 μL DMSO,微型振蕩器振蕩混勻,酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(absorbance,A),根據(jù)A值及公式(3)計算細(xì)胞存活率．MTT實驗進(jìn)行3次,并考察相應(yīng)濃度的空白載體對C6細(xì)胞生長抑制的影響．

(3)

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 替莫唑胺辛酯的合成與表征

合成的替莫唑胺辛酯外觀為白色固體粉末,產(chǎn)率為78.2%,mp: 89.1～90.3 ℃,1H NMR結(jié)果見圖2,1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.44(s, 1H), 4.47～4.43(t, 2H), 4.03(s, 3H), 1.86～1.77(m, 2H), 1.48～1.40(m, 2H), 1.33～1.23(m, 8H), 0.86～0.83(t, 3H);13C NMR結(jié)果見圖3,13C NMR(150 MHz, CDCl3)δ: 160.6, 138.7, 135.8, 129.6, 128.6, 66.2, 36.7, 29.8, 29.2, 28.7, 25.9, 22.7, 14.2;MS結(jié)果見圖4,MS-ESI(m/z): 307.8 [M+1]．

2.2 納米粒處方優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果

納米粒處方的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果如表2所示,采用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行擬合分析,選擇有較大相關(guān)系數(shù)(R2)的擬合方程,P<0.05作為具有統(tǒng)計學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行優(yōu)化．A為油水比;B為PLGA質(zhì)量濃度(mg/mL);C為理論載藥量(%),均是編碼值,響應(yīng)值包封率(Y1)、粒徑(Y2)對A、B、C3因素的數(shù)學(xué)回歸模型如下:Y1=90.26+1.39A-1.09B-3.61C+1.24AB-0.023AC+9.90BC-7.36A2-3.48B2-23.22C2(R2=0.964 5);Y2=141.78-18.34A+12.83B-2.56C+0.76AB+9.22AC+0.65BC+51.60A2+8.47B2-7.84C2(R2=0.981 5)．

圖2 替莫唑胺辛酯核磁共振氫譜

圖3 替莫唑胺辛酯核磁共振碳譜

對模型進(jìn)行方差分析如表3、表4所示,結(jié)果顯示,對替莫唑胺辛酯Y1與Y2建立的上述回歸模型P<0.05,所建模型具有統(tǒng)計學(xué)意義;模型失擬項不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明模型與實際情況吻合好,能較好地描述響應(yīng)值與各因素之間的關(guān)系．Y1、Y2模型相關(guān)系數(shù)R2分別為0.964 5和0.981 5,R2>0.900 0,模型相關(guān)性良好．

根據(jù)上述二項式擬合方程繪制各因素對指標(biāo)影響趨勢的三維響應(yīng)面,見圖5、圖6,響應(yīng)面的最高點為響應(yīng)值的極值．通過三維響應(yīng)面圖評價各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系,保持第3個變量為常數(shù),分析2個獨自的因素對響應(yīng)值的響應(yīng)情況．

對包封率的影響:各因素對包封率影響的響應(yīng)面結(jié)果見圖5.由圖5可以看出理論載藥量(C)對包封率影響顯著(P<0.05).該因素的軸向響應(yīng)面最陡峭,隨著理論載藥量的增加,包封率呈現(xiàn)出逐漸增大后下降的趨勢．各因素對包封率的影響大小依次為:理論載藥量(C)>油水比(A)>PLGA質(zhì)量濃度(B)．

圖4 替莫唑胺辛酯質(zhì)譜圖

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 包封率方差分析表

表4 粒徑方差分析表

圖5 各因素對TOE-NPs包封率影響的響應(yīng)面圖

對粒徑的影響:各因素對粒徑影響的響應(yīng)面結(jié)果見圖6,由圖可以看出油水比(A)、PLGA質(zhì)量濃度(B)對粒徑的影響顯著(P<0.05),隨著油水比的增大,粒徑呈現(xiàn)出逐漸減小后增加的趨勢;隨著PLGA質(zhì)量濃度的增大,粒徑逐漸增大．各因素對粒徑的影響大小依次為:油水比(A)>PLGA質(zhì)量濃度(B)>理論載藥量(C)．

載藥納米粒最優(yōu)處方應(yīng)具備納米粒包封率“最大”,平均粒徑分布“最小”,通過回歸模型預(yù)測的最佳處方組成為:油水比為1∶3.3,PLGA質(zhì)量濃度為8.80 mg/mL,理論載藥量為17.77%．包封率預(yù)測值為90.55%,平均粒徑為135.4 nm,按最優(yōu)處方組成,制備3批載藥納米粒,經(jīng)測定包封率為(93.29±1.93) %,平均粒徑為136.2±1.8 nm,預(yù)測值和實測值的包封率和粒徑分布偏差分別為-0.61%和-3.03%偏差，結(jié)果表明兩者的實驗值與預(yù)測值吻合程度高．

偏差=(預(yù)測值-實測值)/預(yù)測值×100%. (4)

圖6 各因素對TOE-NPs粒徑影響的響應(yīng)面圖

2.3 載藥納米粒的表征

按最佳處方組成制備的TMZ-NPs和TOE-NPs外觀為帶有淡藍(lán)色乳光的溶液,見圖7(a);TMZ-NPs和TOE-NPs透射電鏡結(jié)果分別見圖7(b)和圖7(c),從電鏡結(jié)果可以看出,所制備的納米粒形態(tài)近似于球形,沒有黏連團(tuán)聚,結(jié)構(gòu)緊密．TMZ-NPs和TOE-NPs的粒徑分布、PDI、Zeta電位、包封率和載藥量結(jié)果如表5所示,納米粒粒徑呈正態(tài)分布,平均粒徑在130～140 nm之間,PDI<0.1,粒徑分布均勻,Zeta電位值在-24～-20 mV之間,體系穩(wěn)定性良好．TMZ-NPs載藥量僅為0.62%,將TMZ酯化修飾為TOE后,納米粒對藥物的包載率顯著提高,TOE-NPs載藥量(以TMZ計)達(dá)8.13%,包封率為93.29%,分別為TMZ-NPs的13.11倍和16.66倍．這可能是由于TMZ水溶性、脂溶性均較差,將TMZ酯化修飾為TOE后,藥物脂溶性增強(qiáng),改善了與PLGA的生物相容性,因此提高藥物的包載量．由實驗結(jié)果可得出TOE-NPs可以明顯改善TMZ納米粒載藥量低的問題,為臨床有效治療GBM提供了可行性．

圖7 TMZ-NPs與TOE-NPs外觀及透射電鏡照片

表5 TMZ-NPs與TOE-NPs的體外表征

由于TMZ及TOE在體內(nèi)pH=7.4生理環(huán)境下自發(fā)水解產(chǎn)生甲基重氮陽離子發(fā)揮其抗腫瘤作用,為準(zhǔn)確測定藥物的釋放行為,選擇pH=5.5釋放條件測定各組藥物的釋放,TOE-Sol、TMZ-NPs、TOE-NPs體外累積釋放結(jié)果見圖8.由釋放曲線可知,TOE-Sol釋放迅速,8 h累計釋放率為(99.10±3.86) %,而將TOE制備成納米粒后,藥物包載于納米粒,可實現(xiàn)藥物的緩慢釋放,緩釋效果優(yōu)于TMZ-NPs,120 h時藥物累計釋放率為(88.13±2.39) %．

圖8 TMZ-NPs、TOE-NPs、TOE-Sol體外累積釋放曲線

2.4 抗腦膠質(zhì)瘤研究

不同濃度的游離藥物和載藥納米粒與C6細(xì)胞共孵育48 h后,細(xì)胞存活率結(jié)果見圖9.由圖9可以看出,空白納米粒處理細(xì)胞48 h后,各組細(xì)胞存活率均大于90%,表明制備納米粒的載體材料具有較好的生物相容性和安全性．TMZ和TOE對C6細(xì)胞的生長抑制作用均呈劑量依賴性,TOE溶液對C6細(xì)胞的生長抑制作用強(qiáng)于TMZ溶液(IC50, 34.89 μmol/L vs 231.29 μmol/L,P<0.01), 將二者制備成納米粒后,仍是如上的細(xì)胞生長抑制趨勢,在藥物濃度高于40 μmol/L時,TOE-NPs對C6細(xì)胞的生長抑制作用與TMZ-NPs相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)．TMZ-NPs和TOE-NPs的IC50值分別為169.12 μmol/L和28.16 μmol/L,TOE-NPs較 TMZ-NPs有更佳的體外抗腫瘤效果．

與TMZ-Sol相比,*P<0.05,**P<0.01;

3 結(jié) 論

本研究合成了TOE模型藥物,體外C6細(xì)胞生長抑制作用比TMZ更高．采用Box-Behnken響應(yīng)面法篩選出制備納米粒的最佳處方．按最佳處方制備的TOE-NPs的包封率、載藥量分別為TMZ-NPs的16.66和13.11倍,具有較高的包封率與載藥量,粒徑分布均勻且小于200 nm,制劑適合經(jīng)鼻給藥方式,TOE-NPs體外釋放平穩(wěn),相同濃度給藥劑量下對膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的生長抑制作用顯著強(qiáng)于TMZ-NPs,具有較高的膠質(zhì)瘤治療潛力,有望成為經(jīng)鼻遞送治療腦膠質(zhì)瘤的良好候選藥物制劑．