小鼠生物法與ELISA法對腹瀉性貝類毒素的檢測比較

杜偉，張曉輝，孔蕾，王鼎南，鄭重鶯*

(1.浙江省海洋監(jiān)測預(yù)報(bào)中心，浙江 杭州 310007； 2.浙江省海洋科學(xué)院，浙江 杭州 310010； 3.浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 310023)

赤潮(red tides，國際上也稱有害藻華harmful algal blooms)是指在一定環(huán)境條件下，海洋生物(以單細(xì)胞藻類為主)迅速增殖或積聚而產(chǎn)生的一種海水變色的自然現(xiàn)象[1]。赤潮發(fā)生時(shí)，區(qū)域海洋生態(tài)系統(tǒng)失衡，赤潮優(yōu)勢種優(yōu)勢度明顯，群落中海洋生物多樣性明顯降低；在赤潮消亡期，大量赤潮生物降解過程在短時(shí)間內(nèi)急劇消耗所在海域中的氧氣，造成異養(yǎng)生物因缺氧而死亡，進(jìn)而對區(qū)域海洋環(huán)境和生物、海洋漁業(yè)資源、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及濱海旅游業(yè)等產(chǎn)生不利影響，如引發(fā)赤潮的海洋生物為有毒赤潮藻，其產(chǎn)生的貝類毒素通過食物鏈不僅影響區(qū)域海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能和穩(wěn)定性，還有可能威脅海洋食品安全，人類誤食含有貝類毒素(赤潮藻毒素)的食品時(shí)可能中毒，嚴(yán)重者有死亡風(fēng)險(xiǎn)。近些年全球赤潮一直處于高發(fā)狀態(tài)，而我國近岸海域赤潮也處于高發(fā)狀態(tài)，且近年時(shí)有人類誤食含赤潮藻毒素的貝類而發(fā)生中毒或疑似中毒的報(bào)道[2-4]。

腹瀉性貝類毒素(diarrhetic shellfish poisoning，DSP)是在世界范圍內(nèi)廣布并引起人類中毒較多的一類赤潮藻毒素[5]，具有相對熱穩(wěn)定性，日常方式加熱很難使其降解或使毒性減小，且該毒素在貝類肌肉和內(nèi)臟中分布情況沒有明顯差異，很難通過去除內(nèi)臟等方式減少食用DSP引起中毒的概率。它是一類聚醚類或大環(huán)內(nèi)酯類化合物，脂溶性，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能夠在貝類等海洋生物體內(nèi)積累(富集)、降解，甚至有些毒素可在貝類體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化[6]。根據(jù)結(jié)構(gòu)特征，一般將常見DSP分為3大類，其中常引起人類中毒的種類為酸性成分的大田軟海綿酸(okadaic acid，OA)及其天然衍生物鰭藻毒素(dinophysistoxins，DTX 1～3)，而中性成分的扇貝毒素(pectenotoxins，PTXs)、其他成分的蝦夷扇貝毒素(yessotoxins，YTXs)及45-羥基扇貝毒素則比較少見?？僧a(chǎn)生腹瀉性貝類毒素的有毒赤潮藻主要為海洋甲藻，如鰭藻(Dinophysisspp.)、原甲藻(Prorocentrumspp.)等[7]。

作為生物毒素，DSP的致毒機(jī)理比較復(fù)雜，一般認(rèn)為其活性成分軟海綿酸可抑制哺乳動(dòng)物血液細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)磷酸酶的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)去磷酸化過程受到抑制，進(jìn)而影響消化道、肝臟等器官功能，最直觀的表現(xiàn)有惡心、嘔吐、腹瀉等[8]。小鼠試驗(yàn)表明，DSP對其毒性可作用于肝臟、心肌等器官，同時(shí)還具有致畸、致突變作用[9]。另外，DSP對人和動(dòng)物的致毒影響可能有疊加效應(yīng)，多次低濃度、亞慢性中毒可能會(huì)增加其對中毒者健康的危害。

隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，開發(fā)出多種對DSP的檢測方法，包括小鼠生物法、色譜法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、電泳法、免疫學(xué)檢測技術(shù)、細(xì)胞毒性檢測技術(shù)等，其中免疫學(xué)檢測技術(shù)在實(shí)踐中常用的為酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 貝類中腹瀉性貝類毒素的測定》(GB 5009.212-2016)中增加了酶聯(lián)免疫吸附法作為食品國家標(biāo)準(zhǔn)方法[10]。本文比較了小鼠生物法與ELISA法檢測樣品中DSP含量的差異，旨在為一線檢測人員測定水產(chǎn)品中DSP含量提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用竹蟶、紫貽貝、厚殼貽貝、蛤蜊購自浙江省水產(chǎn)碼頭海鮮市場。試驗(yàn)用小鼠為ICR系雄性小鼠，體重18～20 g；腹瀉性貝類毒素檢測試劑盒(品牌為ABRAXIS)；腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)品OA(軟海綿酸，純度99.5%，加拿大國家研究院海洋研究所)。其他試驗(yàn)用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為去離子水。

試驗(yàn)設(shè)備與量器。酶標(biāo)儀，精度為0.01 g的電子天平，機(jī)械秒表及其他實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備與量器等，所有需要計(jì)量的設(shè)備和量器均在有效期內(nèi)。

1.2 樣品處理與制備

取購自水產(chǎn)市場的竹蟶、紫貽貝、厚殼貽貝及蛤蜊，用自來水充分洗凈貝類外殼，打開外殼，用自來水淋洗貝類外殼內(nèi)部以去除泥沙及其他外來雜質(zhì)，用鑷子取出貝肉，用去離子水洗凈取出的貝肉，然后瀝水10 min，挑揀出貝肉中碎殼等雜物，用均質(zhì)器將貝肉均質(zhì)備用。

竹蟶加標(biāo)樣品處理。分別取往年實(shí)驗(yàn)室檢測任務(wù)中竹蟶DSP陰性樣品10份，每份500 g，將貝肉座均質(zhì)化處理，1份作為陰性控制樣，其余9份陰性樣品分別加入配制好的DSP含量為175.00、150.00、125.00、100.00、50.00、25.00、10.00、5.00、4.00 μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，震蕩1 min，制成竹蟶加標(biāo)樣1～9。

1.3 小鼠生物測定法

從已均質(zhì)好的貝類樣品中提取DSP和小鼠生物法試驗(yàn)參照GB 5009.212—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 貝類中腹瀉性貝類毒素的測定》第一法 小鼠生物法執(zhí)行[10]，所有樣品做平行樣。小鼠生物法檢測DSP含量檢出限為50 MU·kg-1。

1.4 ELISA法測定

取1.00 g均質(zhì)后的竹蟶、紫貽貝、厚殼貽貝、蛤蜊、竹蟶陰性樣品或竹蟶加標(biāo)樣品于干凈離心管中，加入甲醇溶液(V∶V為8∶2)10 mL，充分振蕩，將混合液于4 000 r·min-1離心10 min，取上清液200 μL，用樣品稀釋緩沖液稀釋到2.0 mL，振蕩1 min；取上步驟樣品溶液100 μL，待測。所有樣品做平行樣測定。

按照試劑盒自帶的說明書操作ELISA法檢測程序，根據(jù)本試驗(yàn)樣品提取、提取液稀釋倍數(shù)及試劑盒本身的最低檢出限值，確定本試驗(yàn)ELISA法檢測DSP的檢出限為10 μg·kg-1，滿足GB 5009.212—2016第二法 酶聯(lián)免疫吸附法的規(guī)定[10]。

1.5 定量計(jì)算

試驗(yàn)結(jié)果按GB 5009.212—2016[10]中規(guī)定的計(jì)算方法定量計(jì)算，其中小鼠生物法計(jì)算結(jié)果值(MU·kg-1)、ELISA法計(jì)算結(jié)果值(μg·kg-1)。本試驗(yàn)對于OA的檢測結(jié)果等同于對DSP的檢測結(jié)果。根據(jù)西太平洋地區(qū)DSP毒力經(jīng)驗(yàn)值，按照1 MU(OA)=4 μg(OA)將小鼠生物法檢測結(jié)果單位進(jìn)行換算成μg·kg-1。

平行樣的處理方式。檢測結(jié)果均為陽性時(shí)，DSP含量取算數(shù)平均值；檢測結(jié)果均為陰性時(shí)，DSP含量報(bào)未檢出；平行樣中1個(gè)檢測結(jié)果為陽性、1個(gè)結(jié)果為陰性，則陰性檢測結(jié)果按照檢出限的1/2參加計(jì)算，即樣品中DSP含量檢測結(jié)果為陽性樣品結(jié)果值和檢出限1/2值的算數(shù)平均值。

加標(biāo)樣檢測結(jié)果和加標(biāo)回收率修約規(guī)則。檢測結(jié)果按照“四舍六入五留雙”規(guī)則修約至整數(shù)，加標(biāo)回收率按照“四舍六入五留雙”規(guī)則保留3位有效數(shù)字。

在園林景觀的設(shè)計(jì)中，園林植物配置應(yīng)與周邊環(huán)境氛圍相結(jié)合，例如，學(xué)校的景觀設(shè)計(jì)，應(yīng)根據(jù)學(xué)校的環(huán)境，選擇桃樹和李樹作為主要樹種，如紫葉李、桃樹等，以頌揚(yáng)教師默默耕耘、無私奉獻(xiàn)的精神；政府機(jī)關(guān)的設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)政府機(jī)關(guān)的環(huán)境景觀特點(diǎn)，選擇荷花和竹子作為主要樹種，以表達(dá)公務(wù)員出淤泥而不染、全心全意為人們服務(wù)的精神；居住區(qū)的景觀設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)居住區(qū)的環(huán)境景觀特色，選擇柏樹和梧桐樹作為主要樹種，以代表人們的高潔莊嚴(yán)、長壽無疆的寓意。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，ELISA法和小鼠生物法均可用于對貝類樣品中DSP含量進(jìn)行檢測。

采用小鼠法檢測，試驗(yàn)中竹蟶、紫貽貝、厚殼貽貝、蛤蜊、竹蟶陰性等樣品，以及竹蟶加標(biāo)樣品4～9等樣品檢測結(jié)果為陰性，即沒有檢出樣品中含有DSP；試驗(yàn)中竹蟶加標(biāo)樣品1檢測結(jié)果為陽性；試驗(yàn)中竹蟶加標(biāo)樣品2和3，其均有1個(gè)平行樣檢測結(jié)果為陰性，相對應(yīng)的平行樣檢測結(jié)果為陽性，按照本試驗(yàn)對于平行樣檢測結(jié)果的處理方式，竹蟶加標(biāo)樣品2和3的檢測結(jié)果為陰性。

表1 不同檢測方法對DSP含量的影響

采用ELISA法檢測，試驗(yàn)中竹蟶加標(biāo)樣品1～8檢測結(jié)果為陽性，其他樣品檢測結(jié)果均為未檢出，加標(biāo)樣品1～8的檢測結(jié)果加標(biāo)回收率為84.0%～100%，滿足實(shí)驗(yàn)室ELISA法加標(biāo)回收率(70.0%～120%)的要求。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，檢測貝類樣品中DSP含量時(shí)，樣品中DSP含量在300 μg·kg-1以上時(shí)，2種檢測方法均為陽性，但2種檢測方法結(jié)果有差異；樣品中DSP含量在200～300 μg·kg-1時(shí)，ELISA法可準(zhǔn)確檢測樣品中DSP含量，而小鼠生物法可出現(xiàn)假陰性反應(yīng)；樣品中DSP含量在10～200 μg·kg-1時(shí)，利用小鼠生物法無法檢測樣品中DSP含量，而ELISA法可準(zhǔn)確檢測樣品中DSP；在DSP陰性樣品中兩者檢測結(jié)果一致。

綜上，對于陰性樣品及DSP加標(biāo)量在10 μg·kg-1以下的貝類樣品，小鼠生物法和ELISA法檢測結(jié)果均為陰性。對于DSP加標(biāo)量在10～200 μg·kg-1的竹蟶加標(biāo)樣品，小鼠生物法無法檢測到樣品中的DSP，而ELISA法檢測結(jié)果為陽性，且其檢測值以加標(biāo)回收率計(jì)算，滿足試驗(yàn)要求。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)主要對小鼠生物法和ELISA法檢測貝類中DSP含量做了比較研究，試驗(yàn)結(jié)果表明,貝類中DSP含量處于不同濃度水平時(shí)，兩種檢測方法的檢測存在差異。

貝類中DSP含量在10～200 μg·kg-1時(shí)，ELISA法可以準(zhǔn)確檢測貝類中DSP含量，而小鼠生物法的檢測結(jié)果為未檢出，這跟小鼠生物法的檢出限(0.05 MU·g-1，等同于200 μg·kg-1)偏高有關(guān)，說明小鼠生物法無法檢測到低濃度水平的DSP。

貝類中DSP含量在10 μg·kg-1以下時(shí)，兩種檢測方法的檢測結(jié)果一致。

正常情況下，在方法檢出限以上，通過對貝類樣品提取液進(jìn)行合適倍數(shù)稀釋，利用ELISA法和小鼠生物法對貝類樣品DSP含量檢測時(shí)能得到吻合度較好的結(jié)果；但從檢測方法原理上分析，小鼠生物法檢測結(jié)果會(huì)略高于ELISA法檢測結(jié)果。究其原因，在提取充分前提下，利用小鼠生物法檢測毒性試驗(yàn)的結(jié)果值包含了樣品中DSP含量的總和，而現(xiàn)在市售貝類毒素ELISA法檢測試劑盒利用的原理是抗體-抗原反應(yīng)，而用于微孔板包被或后期試驗(yàn)中添加的DSP抗體均為單抗。比如本次試驗(yàn)中使用的ELISA檢測試劑盒，包被在微孔板上的二抗及試驗(yàn)中添加的一抗均為單抗，其相對抗原主要為DSP中的OA、DTX-1、DTX-2等，而對其他組分的DSP交叉反應(yīng)率較小。

本試驗(yàn)出現(xiàn)小鼠生物法檢測結(jié)果比ELISA法較低現(xiàn)象，這雖然和兩種檢測方法原理的對比分析相悖，但在現(xiàn)實(shí)試驗(yàn)中可能較為常見。作為傳統(tǒng)檢測方法，小鼠生物法以檢測步驟操作簡單和可檢測樣品中DSP總量一直被用作檢測DSP含量的首選方法，但實(shí)際檢測過程中，因有機(jī)溶劑提取階段很難保證DSP被完全提取、減壓蒸餾濃縮階段存在DSP隨有機(jī)溶劑揮發(fā)的可能，往往會(huì)使檢測結(jié)果偏低，甚至出現(xiàn)假陰性。小鼠生物法所用樣品量較大，一般為200 g，這使得其在樣品量較小時(shí)很難用于檢測。

經(jīng)過多年發(fā)展，ELISA法已經(jīng)被很好應(yīng)用到檢測貝類中DSP含量試驗(yàn)，而且該方法在2016年首次被寫進(jìn)國家食品檢測標(biāo)準(zhǔn)中，依靠其較低檢出限、較高靈敏度、較快檢測速度逐漸被廣大一線檢測人員所接受，由于需要專門檢測設(shè)備和較高檢測試劑盒價(jià)格，其推廣度受到影響。具體到實(shí)際試驗(yàn)中，在需要檢測大批量貝類樣品時(shí)，可以考慮先用ELISA方法進(jìn)行初步篩選，如果檢測結(jié)果為陰性，可據(jù)實(shí)出具檢測報(bào)告；如果檢測結(jié)果為陽性，則可利用小鼠生物法或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行確認(rèn)。檢測個(gè)別樣品時(shí)，考慮到成本及操作可行性，可考慮使用小鼠生物法。日常檢測中將兩種方法結(jié)合使用，能夠更加準(zhǔn)確檢測貝類樣品中DSP含量。