火焰南天竹組培快繁體系的探討

宋帥杰，黃坤，錢如南，劉峰，林立，陳際伸

(1.匯綠園林建設(shè)發(fā)展有限公司，浙江 寧波 315800； 2.寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院 景觀生態(tài)學(xué)院，浙江 寧波 315502)

火焰南天竹(NandinadomesticaFirepower)屬小檗科南天竹屬常綠灌木[1]，喜溫暖多濕及通風(fēng)良好的半陰環(huán)境，適宜生長(zhǎng)在富含腐殖質(zhì)的沙質(zhì)壤土上?；鹧婺咸熘裰仓臧?，莖節(jié)較短[2]。待秋季降溫時(shí)，葉片由翠綠變?yōu)轷r紅，紅葉可持續(xù)至翌春，極具觀賞價(jià)值，在南方園林中使用較普遍[3]。南天竹在園林中多叢植或孤植于花徑和庭院，也可做地被及色塊植物，是良好的花徑與庭院材料，市場(chǎng)需求量較大；同時(shí)，南天竹的根、莖、葉均有藥用價(jià)值[4]。扦插、分株為火焰南天竹常用的繁殖方式，但存在繁殖系數(shù)低、品種特性易退化、培育周期較長(zhǎng)等缺陷[5]。近年來，隨著火焰南天竹廣泛應(yīng)用于城市及鄉(xiāng)鎮(zhèn)的園林綠化建設(shè)中，觀賞苗木的需求日益增多，傳統(tǒng)的火焰南天竹的繁殖方法已無法滿足市場(chǎng)需求[6]。運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行火焰南天竹繁殖的研究日益增多。根據(jù)現(xiàn)有的火焰南天竹組培快繁技術(shù)，外植體萌芽率約為30%～50%，生根率不足50%，增殖系數(shù)約1～3，且存活率較低，難以滿足大規(guī)模栽培及工業(yè)化生產(chǎn)的需求[7]。為此，通過對(duì)比不同滅菌時(shí)間、培養(yǎng)基和激素濃度及移栽基質(zhì)等方面的研究，旨在探索出一套外植體萌芽率高、增殖系數(shù)大、生根率高的火焰南天竹快繁技術(shù)，為火焰南天竹的產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 外植體

火焰南天竹購自嘉興中瑞生物科技有限公司，4月初選取株高約40 cm的長(zhǎng)勢(shì)健壯均勻的實(shí)生苗，剪取1～2 cm的莖尖作為組培外植體材料。

1.2 培養(yǎng)基

配置MS、1/2 MS、WPM和B5等基本培養(yǎng)基，并添加不同種類和濃度的外源激素，以及30 g·L-1蔗糖和0.7%瓊脂，pH值為5.8，經(jīng)121 ℃高溫滅菌20 min后待用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 滅菌時(shí)間對(duì)成活率的影響

將生長(zhǎng)健壯、無病害的火焰南天竹采回后用肥皂水浸泡5 min，然后用流動(dòng)水沖洗30 min，切取1～2 cm的莖尖進(jìn)行滅菌處理。在無菌環(huán)境下，先用70%酒精消毒5 s，再用10% NaClO滅菌，分別設(shè)定5、8、10、12、15、20 min的滅菌時(shí)間，然后用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干水分，切取莖尖部分約2 mm，接種到培養(yǎng)基中。7 d后統(tǒng)計(jì)其污染率、成活率及死亡率等。

1.3.2 不同培養(yǎng)基和外源激素對(duì)不定芽誘導(dǎo)率的影響

采用MS，1/2MS，WPM和B5為基本培養(yǎng)基，外源激素為6-BA(0.5、1.0和1.5 mg·L-1)、NAA(0.1、0.2和0.5 mg·L-1)和IBA(0.1 mg·L-1)，活性炭(AC)1.0 g·L-1，其他條件為蔗糖30 g·L-1，瓊脂粉6.0 g·L-1，pH值5.8。將滅菌處理后的火焰南天竹莖尖迅速接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每處理10瓶，每瓶接6個(gè)，30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.3.3 不同外源激素和活性炭對(duì)不定芽增殖率的影響

繼代增殖培養(yǎng)時(shí)，以誘導(dǎo)培養(yǎng)的新芽莖段為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖30 g·L-1，添加不同濃度的6-BA(0.5和1.0 mg·L-1)和NAA(0.1、0.2和0.5 mg·L-1)，并添加IAA 0.1 mg·L-1和活性炭1.0 g·L-1，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)50瓶，每瓶接種7個(gè)新芽，繼代培養(yǎng)3次后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.3.4 IBA濃度和活性炭對(duì)生根率的影響

生根培養(yǎng)時(shí)，以高2 cm的繼代增殖苗為試驗(yàn)材料，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖30 g·L-1，分別添加IBA(0.5、1.0和1.5 mg·L-1)和活性炭(1.0、2.0、4.0和8.0 g·L-1)，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)30瓶，每瓶接種10個(gè)。

1.3.5 基質(zhì)對(duì)組培苗移栽成活率的影響

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的試管苗，將其置于自然光條件下培養(yǎng)3～4 d后打開瓶蓋，煉苗7 d后將幼苗取出，洗盡表面瓊脂，除去較長(zhǎng)的根及部分葉片，移入泥炭土∶蛭石∶珍珠巖配置比例分別為2∶2∶1、3∶1∶1、8∶1∶1的不同營養(yǎng)土中。另一個(gè)基質(zhì)全部由泥炭土組成，蓋上薄膜進(jìn)行保溫保濕培養(yǎng)。每日觀察、記錄移栽苗的生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2007和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時(shí)間對(duì)成活率的影響

研究6個(gè)滅菌時(shí)間對(duì)火焰南天竹莖尖成活率的影響。由表1可知，經(jīng)10%的NaClO處理外植體5 min，火焰南天竹外植體的死亡率最低，僅為12%，但其污染率最高，達(dá)72%；處理20 min后，外植體死亡率高達(dá)50%，而污染率為15%；經(jīng)NaClO處理12 min的火焰南天竹的外植體死亡率為14%，污染率為23%，有效成活率最高，可達(dá)63%，效果最佳。

表1 不同滅菌時(shí)間對(duì)火焰南天竹成活率的影響

2.2 不同培養(yǎng)基和外源激素對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

由表2可知，4種培養(yǎng)基上火焰南天竹的莖芽均有萌發(fā)和生長(zhǎng)。從誘導(dǎo)率可以看出，不同培養(yǎng)基對(duì)火焰南天竹外植體誘導(dǎo)的影響差異顯著。以MS為基本培養(yǎng)基的火焰南天竹的不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到58%，顯著高于其他培養(yǎng)基。由此可知，MS培養(yǎng)基較適合火焰南天竹外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

據(jù)初代培養(yǎng)基初選的結(jié)果，選擇MS為基本培養(yǎng)基，并對(duì)6-BA和NAA濃度進(jìn)行了調(diào)整，篩選最適誘導(dǎo)率配方。由表3可以看出，6-BA、NAA和IBA的不同配比均可誘導(dǎo)火焰南天竹的莖段萌發(fā)，但誘導(dǎo)率差別較大。其中，6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1的誘導(dǎo)率最高，達(dá)87%，顯著高于其他處理。當(dāng)6-BA達(dá)到1.5 mg·L-1時(shí)，不定芽分化率反而降低，說明6-BA濃度不是越高越好。6-BA 1.0 mg·L-1時(shí)，低濃度NAA能誘導(dǎo)不定芽分化，但NAA 0.5 mg·L-1時(shí)，芽分化受到抑制。因此，火焰南天竹莖段誘導(dǎo)不定芽最佳激素濃度配比為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1。7 d后其不定芽生長(zhǎng)點(diǎn)開始變綠，長(zhǎng)出綠色新葉，1個(gè)月后可觀察到火焰南天竹的叢生苗。

2.3 不同濃度外源激素對(duì)不定芽增殖的影響

MS培養(yǎng)基中添加適量的活性炭能促進(jìn)火焰南天竹不定芽的生長(zhǎng)和發(fā)育。由表4可知，不同外源激素及濃度下，火焰南天竹的增殖表現(xiàn)不同。低濃度的6-BA不利于叢生芽的增殖，高濃度的NAA易形成愈傷組織，但形成的叢生芽生長(zhǎng)緩慢，且莖段難伸長(zhǎng)。添加適宜的IAA和活性炭有利于其增殖。由此可知，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1是火焰南天竹不定芽增殖的最佳組合，增殖系數(shù)最高可達(dá)5.29。

表3 不同濃度外源激素對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

表4 不同濃度外源激素對(duì)不定芽增殖的影響

2.4 不同IBA濃度和活性炭對(duì)火焰南天竹生根率的影響

表5表明，火焰南天竹組培苗生根率較高，最高可達(dá)98%。每個(gè)組培苗平均可長(zhǎng)出3～5個(gè)不定根，且組培苗生長(zhǎng)健壯，長(zhǎng)勢(shì)均勻。一定濃度的IBA和活性炭同時(shí)使用可提高組培苗的生根率。不添加IBA和活性炭時(shí)，組培苗的生根率較低，最低僅有67%，根系生長(zhǎng)緩慢且細(xì)小。培養(yǎng)基中加入活性炭可顯著提高生根率，隨著活性炭濃度的增加，生根率呈先增加后減小的趨勢(shì)。不加任何激素也能有效促火焰南天竹生根，但根較細(xì)且生根所需時(shí)間較長(zhǎng)。綜上所述，1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1+AC 4.0 g·L-1為火焰南天竹組培苗的最佳生根培養(yǎng)基，其組培苗根系粗壯，愈傷組織較少，煉苗成活率較高。

表5 不同IBA濃度和活性炭對(duì)火焰南天竹 生根率的影響

2.5 不同的基質(zhì)對(duì)火焰南天竹組培移栽苗成活率的影響

從表6可以看出，不同基質(zhì)直接影響組培苗的移栽成活率。煉苗7 d后移栽至混合基質(zhì)泥炭土∶蛭石∶珍珠巖8∶1∶1上的火焰南天竹組培苗移栽成活率最高，達(dá)94%；在全泥炭的基質(zhì)中組培苗移栽成活率最低。此外，從各試驗(yàn)組苗高可以看出，泥炭土含量高的基質(zhì)，其組培苗生長(zhǎng)更快，且葉色濃綠，苗更健壯，但全泥炭影響土壤的透氣性和保水性，不利于組培苗生長(zhǎng)。

表6 不同基質(zhì)對(duì)火焰南天竹組培苗移栽 成活率的影響

3 討論

火焰南天竹是一種木本植物，而木本植物再生體系的建立不僅周期長(zhǎng)，還具有一定難度。滅菌時(shí)間是影響火焰南天竹成活率的重要因素，滅菌時(shí)間不足會(huì)導(dǎo)致外植體污染率升高、成活率較低。本研究結(jié)果表明，10%NaClO對(duì)火焰南天竹滅菌12 min的效果最佳。另外，不同培養(yǎng)基和外源激素濃度對(duì)火焰南天竹不定芽的誘導(dǎo)及增殖具有重要作用。劉中兵等[8]在南天竹初代培養(yǎng)條件研究表明，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1為南天竹的最佳誘導(dǎo)組合，最高誘導(dǎo)率為74.4%，造成結(jié)果差異的原因可能是不同品種的南天竹所需的6-BA不同；鄧玉營等[9]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA濃度達(dá)0.8 mg·L-1時(shí)，組培苗會(huì)出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。所以，培養(yǎng)基中6-BA濃度不宜太高，這與本文研究結(jié)果一致。本研究通過不同外源激素濃度對(duì)火焰南天竹不定芽誘導(dǎo)的影響結(jié)果表明，不同激素配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)的結(jié)果不同，6-BA濃度并非越高越好，當(dāng)濃度達(dá)到1.5 mg·L-1時(shí)，火焰南天竹不定芽分化率反而降低，以MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1組合對(duì)火焰南天竹的外植體誘導(dǎo)率最高，可達(dá)87%。周志疆等[10]在火焰南天竹組織培養(yǎng)體系建立與優(yōu)化的研究中表明，火焰南天竹最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，最高增殖系數(shù)為3.5；杜永芹等[11]在耐寒彩葉樹種火焰南天竹的快繁技術(shù)研究表明，MS +6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1為最佳增殖培養(yǎng)基，最高增值系數(shù)為4.12，其增值系數(shù)遠(yuǎn)低于本研究結(jié)果(5.29)，分析原因可能是由于基礎(chǔ)培養(yǎng)基及外源激素不同對(duì)后期組培苗的生長(zhǎng)有一定影響。王春等[12]對(duì)南天竹進(jìn)行生根試驗(yàn)表明，添加IBA 0.25 mg·L-1可使南天竹的生根率最高達(dá)87.33%。周志疆等[10]以1/2 MS+IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1為生根培養(yǎng)基，生根率可達(dá)97%。本研究通過IBA和活性炭對(duì)生根壯苗的影響發(fā)現(xiàn)，在1/2 MS基本培養(yǎng)基中添加IBA 0.5 mg·L-1和活性炭4.0 g·L-1，可顯著提高火焰南天竹的生根率，最高可達(dá)98%，且根系粗壯。將組培苗移栽至泥炭土∶蛭石∶珍珠巖為8∶1∶1的混合基質(zhì)中成活率最高，可達(dá)94%，組培苗生長(zhǎng)較快、生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)均勻且適應(yīng)性強(qiáng)。生根困難及移栽成活率低是木本組培中比較突出的問題，阻礙了組培快繁技術(shù)在生產(chǎn)上的應(yīng)用與發(fā)展[13-14]。在培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素IBA和活性炭可明顯促進(jìn)火焰南天竹形成完整的再生植株。生長(zhǎng)素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起促進(jìn)作用，而活性炭也對(duì)培養(yǎng)基中有害代謝產(chǎn)物起到吸附作用[15]。另外，組培苗的移栽同樣是組培的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響到組培苗的成活和質(zhì)量。

本研究所構(gòu)建的一套高效的火焰南天竹組培快繁體系表現(xiàn)出增殖系數(shù)高、培育周期短、組培苗抗逆性好、移栽成功率高的優(yōu)點(diǎn)，接下來在移栽時(shí)期、各階段所需用肥種類及配比等方面還需深入研究。